茶树冷驯化过程中基因表达差异的初步分析

采用mRNA差别显示的方法对茶树冷驯化过程中基因差异表达进行了初步研究,从58条差异片段得到稳定扩增的差异片段23条,用RT-PCR的方法鉴定其假阳性,得到5个阳性片段,其中3个片段在冷驯化过程中表达量增加,另外2个片段的表达量降低。经过BLAST比对分析,其中一个片段序列与高粱反式玉米素-O-葡糖基转移酶同源性较高;一个与黄瓜叶绿体合成相关蛋白基因同源性较高;一个为茶树核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因片段;一个与细胞色素b亚基有较高同源性;还有两个片段序列比对没有同源序列,可能为新基因。     

茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

采用EST测序技术和3′RACE技术,获得了茶树儿茶素代谢途径中的一个重要酶—无色花色素还原酶的全长基因,在GenBank的登录号为EF205148,序列全长1 301 bp,其中开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5 kD,理论等电点为5.81。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约60 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性,例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70%、68%、71%。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况,结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性,而其他基因则与其相关性不大。     

高氮与低氮处理对不同氮效率小麦根系及相关生理特性的影响

提高氮素利用效率是促进农业可持续发展的重要举措之一。为研究高、低氮条件下不同氮效率小麦的根系特征及其生理特性,以3个高效吸收利用氮素（氮高效）小麦品种与3个低效吸收利用氮素（氮低效）小麦品种为试验材料,分析了水培条件下高氮和低氮处理对小麦根系特征和硝酸盐转运蛋白基因表达水平的影响;并分析了大田条件下高氮和低氮处理对不同时期小麦氮代谢关键酶（硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶）活性和氮素积累量的影响。结果表明,在高氮和低氮处理下,氮高效品种的根尖数、根长、根体积、根表面积和根活力均显著高于氮低效品种。氮高效品种的6个硝酸盐转运蛋白基因（ TaNRT2.1、 TaNRT2.2、 TaNRT2.3、 TaNAR2.1、 TaNAR2.2和 TaNAR2.3）的平均相对表达量均显著高于氮低效品种。高氮和低氮处理下,不同时期氮高效品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性以及氮素积累量均显著高于氮低效品种;与高氮处理相比,低氮处理下氮高效品种和氮低效品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性以及氮素积累量均有所降低,其中氮低效品种降低幅度较高。这说明不同氮效率材料在根系相关性状、硝酸盐转运、氮代谢关键酶活性以及氮素积累量存在显著的基因型差异。综上所述,在低氮条件下,小麦根系形态、根系活力、硝酸转运蛋白相关基因和氮代谢关键酶活性对氮素吸收具有重要的调控作用,其综合改良可为氮高效小麦品种的选育提供帮助。     

不同氮效率油菜苗期碳氮代谢差异

为探究氮高效的机制,研究油菜苗期碳氮代谢规律,以两个氮效率差异显著的油菜种质（氮高效种质A294和氮低效种质A364）为材料,通过设置正常（CK, 9.5 mmol/L）和低氮（LN, 0.475 mmol/L）两个处理,比较不同氮效率油菜在根系形态、氮吸收转运同化、光合碳代谢生理指标以及碳氮代谢相关基因表达等方面的差异。结果表明,氮高效的A294在低氮胁迫下根系发达,植株生物量和氮累积量显著高于A364,前者根系吸收及向地上部转运氮的能力较强,而氮同化关键酶硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性在两个种质间无显著差异;同时,A294叶片SPAD值、光合色素含量、净光合速率及磷酸蔗糖合酶基因BnaSPS的表达均更高。进一步分析发现,低氮胁迫下A294根系中硝酸盐转运蛋白基因BnaNPF7.3的表达显著高于A364,而BnaNPF7.2b在A364根系的表达则显著高于A294;此外,A364可溶性糖含量的根叶比及根系中蔗糖合酶基因BnaSUS表达高于A294,说明低氮胁迫下氮高效油菜A294可以将更多的营养元素（氮）分配至地上部,使叶片保持较高的光合速率,为生物体构建提供保障;而氮低效油菜种质A364则倾向于将有限的营养元素（氮）分配在根系并维持其生长发育,同时其根系可溶性糖消耗占比高于A294,导致其根冠比高于A294。由此认为,油菜在响应外界氮缺乏胁迫时,氮素与能量物质（可溶性糖）的分配与消耗差异会影响叶片碳代谢（光合作用、蔗糖合成）速率,最终导致油菜苗期氮效率的差异。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

氮、钾不同营养水平对春玉米氮代谢的影响

采用田间小区试验方法研究了氮、钾不同营养水平对春玉米氮代谢的影响。结果表明：氮代谢指标(可溶性蛋白、硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶)在整个生育时期内呈单峰曲线变化,即从苗期开始逐渐增加,达到高峰后又呈下降趋势,成熟期最低。可溶性蛋白含量在抽雄吐丝期达到最高峰,硝酸还原酶和谷氨酸脱氢酶活性在大喇叭口时期达到最高。各生育时期,氮代谢关键酶活性及可溶性蛋白含量均表现为随氮、钾营养水平的提高先增加后减少的趋势。表明适宜氮、钾肥用量可以增加叶片可溶性蛋白含量及提高硝酸还原酶和谷氨酸脱氢酶活性,过量施用氮、钾肥反而会使其含量或活性下降。     

大麦苗期耐低氮性研究

利用耐低氮差异大麦品种来研究苗期氮代谢相关基因的转录调控,结果发现,大麦地上部和根对低氮胁迫的响应具有差异,低氮胁迫对大麦苗期生长的抑制主要体现在地上部,硝酸还原酶基因HvNIA2、叶绿体型谷氨酰氨合成酶基因HvGS2和铁氧化还原蛋白依赖型谷氨酸合酶基因HvGLU2在耐低氮大麦品种BI-04地上部特异上调表达,HvGLU2在BI-04根部特异上调表达,HvGS2在2个大麦品种根部都上调表达,而在BI-04中反应更快。虽然天冬酰胺合成酶基因HvASN1在2个大麦品种地上部都下调表达,但其在低氮敏感品种BI-45中,低氮胁迫24 h后就很难被检测到。以上结果表明,这些基因在大麦苗期耐低氮中可能起着重要的作用。为了提高大麦耐低氮中定量PCR检测的准确性,除了考虑好试验设计、计算方法和统计分析外,进一步对内参基因的选择进行了筛选。以转录组测序中基因表达没有差异的基因和常用内参基因作为候选内参基因,利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件对低氮胁迫处理大麦幼苗地上部样品进行了内参基因筛选研究,其中ge Norm软件不但可以确定最佳内参基因,还可以确定内参基因最少使用个数。尽管3种软件的筛选结果不尽相同,但是β-TUB6和GAPDH1都被认为是前3个最稳定的内参基因。另外,因为部分候选内参基因用了RNA-seq中没有差异的基因,此次筛选也从侧面部分验证了RNA-seq的准确性。     

锰胁迫对甜菜幼苗光合色素含量及碳氮代谢相关酶活性的影响

研究了盆栽条件下土壤中锰(Mn)污染对甜菜叶片叶绿体色素含量和幼苗期碳、氮代谢相关酶活性的影响。结果表明,随着Mn含量的增加,叶绿素a+b、a/b及类胡萝卜素值逐渐减小;叶片1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)含量下降,蛋白水解酶活性升高;硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)活性呈先升后降的变化趋势,其中以0.8mmol/L处理12d的影响最大。品种间比较,甜单301的类胡萝卜素和Rubisco含量降幅均大于KWS9419,而NR和GS活性在两品种上都显示出低剂量刺激高剂量抑制的特点,且时间累加效应明显。甜单301对Mn污染的敏感性高于KWS9419,而KWS9419对高Mn毒害的耐受性优于甜单301。     

与水稻黑条矮缩病毒p5b互作的水稻基因片段筛选

 由水稻黑条矮缩病毒基因组S5片段第2个开放阅读框（ORF）编码的p5b是一个功能未知的病毒非结构蛋白。构建了酵母双杂交体系的含水稻cDNA表达文库的pGADT7载体,同时将p5b 基因构建到诱饵质粒pGBKT7上（pGBK p5b）,Western Blot和自激活实验结果显示p5b可在酵母中正确表达且无自激活活性。进一步利用p5b蛋白作为诱饵用酵母双杂交筛选水稻cDNA表达文库,鉴定出一些参与光合作用、呼吸作用等重要代谢过程的关键酶基因片段,这些酶可能与p5b蛋白之间存在相互作用,推测这些互作在病株症状发展过程中起作用。     

套作遮荫对大豆不同品种苗期氮代谢的影响

以相对不耐荫的南冬抗022-2、贡秋豆494-1和较耐荫的贡选1号、南豆12为试材,在"玉-豆"套作和单作两种模式下,研究了不同大豆品种苗期氮代谢对套作遮荫的响应。结果表明,套作遮荫下大豆植株全氮含量较高、全碳含量较低,从而使C/N降低,其中叶C/N要明显低于茎。同时,套作遮荫下大豆植株NO3-含量升高,功能叶中NR(硝酸还原酶)和GS(谷氨酰胺合成酶)活性降低。套作遮荫抑制了大豆功能叶片可溶性蛋白的表达,而有利于叶片中氨基酸的积累。这些效应在不同耐荫性大豆品种之间表现出明显差异。耐荫性较强的贡选1号和南豆12在套作遮荫下C/N降低幅度大、可溶性蛋白降低程度小,并且能够保持相对较高的NO3-和氨基酸含量。     

莱茵衣藻氮胁迫基因数字表达谱分析

以正常培养条件下的莱茵衣藻为对照，通过数字表达谱技术对缺氮诱导3 d的藻细胞进行转录水平上的检测，并结合pathway分析。结果表明：差异表达基因共有482个，其中上调表达基因108个，下调表达基因374个；这些差异表达的基因共分布在85个pathways中。此结果为进一步揭示氮元素缺乏诱导微藻油脂积累的分子机理提供有用信息。     

两种肥力水平下冬小麦氮素吸收运转和代谢研究

为给高产、优质、养分高效小麦新品种的选育提供理论依据,研究了大田高肥和低肥两种处理对强筋小麦品种郑麦7698和中筋小麦品种周麦18的氮素吸收运转特性和氮代谢影响。结果表明,小麦植株氮素累积量随生育进程的推进和肥力水平提高均呈逐渐增加趋势,到成熟期积累量达到最高值。增加施肥量可以提高小麦氮素吸收转运量、花后氮同化量和旗叶中游离氨基酸含量。低肥水平下氮代谢同化途径关键酶基因的相对表达量显著高于高水平。郑麦7698的氮素积累量、旗叶中总游离氨基酸含量和氮代谢同化关键酶基因的相对表达量均高于周麦18。两种肥力水平下,郑麦7698的产量和穗粒数均高于周麦18,其中穗粒数差异达到显著水平。增强氮代谢途径关键酶基因的相对表达量,提高小麦植株氮素积累量、花后氮同化量和旗叶总游离氨基酸含量,可实现小麦高产、优质、高效目标。     

小麦幼苗叶片中硝酸盐转运蛋白NRT1和NRT2家族基因对氮饥饿响应的表达分析

硝酸盐转运蛋白NRT1(Nitrate transporter 1)和NRT2(Nitrate transporter 2)家族基因在高等植物氮转运过程中发挥着重要作用。为探讨NRT1和NRT2家族基因在小麦幼苗响应氮饥饿中的作用,本研究测定了氮饥饿处理过程中小麦幼苗的生长参数和叶片中叶绿素、可溶性蛋白、硝酸盐和丙二醛(MDA)的含量,并利用荧光实时定量PCR(qPCR)技术分析了叶片中NRT1(7个)和NRT2(5个)家族基因的转录水平。结果表明,氮饥饿明显抑制小麦幼苗生长,其株高、干鲜重显著下降,叶片叶绿素含量、蛋白质含量和硝酸盐含量均显著降低,而MDA含量却显著升高。在氮饥饿处理后所有测定时间点(2d、4d、6d和8d),小麦幼苗叶片中TaNRT1.1、TaNRT1.2、TaNRT1.7、TaNRT2.3和TaNRT2.4的表达均受到显著抑制;然而,氮饥饿2d时,TaNRT1.4、TaNRT1.8和TaNRT2.1的表达量显著升高;氮饥饿4d时,TaNRT1.3、TaNRT1.5和TaNRT2.5的表达量也显著升高,推测TaNRT1.3、TaNRT1.4、TaNRT1.5、TaNRT1.8、TaNRT2.1和TaNRT2.5可能在小麦幼苗响应氮饥饿中发挥着重要作用。     

不同施氮水平下GS抑制剂对小麦灌浆期碳氮代谢的影响

为了解小麦叶片和籽粒内碳代谢和氮代谢之间的关联性,采用盆栽试验,研究了谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂(Glufosinate)对不同施氮水平下两个小麦基因型灌浆期氮、碳同化特性的影响及其相互关系.结果表明,叶片GS被抑制后,高蛋白类型品种豫麦47籽粒内氮含量显著升高、叶片内可溶性糖含量上升;而低蛋白类型豫麦50则表现出相反的趋势.穗GS被抑制后,高蛋白类型品种豫麦47叶片和籽粒内氮含量均显著下降、叶片和籽粒内的可溶性糖含量也显著下降;而低蛋白类型豫麦50则表现叶片和籽粒内氮含量均显著下降,但可溶性糖含量显著上升.说明高蛋白品种豫麦47籽粒和叶片内氮、碳同化相对独立,而低蛋白品种豫麦50籽粒和叶片内氮、碳同化过程关联紧密.这一结果还说明高蛋白品种籽粒花后氮同化可以直接利用从根部或茎秆而来的氮素,而低蛋白品种则必须经过叶片.因此,在小麦生产上,不同类型品种必须采取不同的氮肥运筹方案,对于低蛋白类型品种,氮肥可适当前移,而对于高蛋白类型品种,则宜采用前促后补的策略.     

耕作方式对砂姜黑土小麦氮代谢及氮素利用效率的影响

为探求砂姜黑土区小麦高产高效的最佳耕作方式,在大田条件下,比较分析了深松、旋耕和常规翻耕三种耕作方式下小麦氮素同化关键酶活性、中间产物含量及氮素的积累、分配、转运和利用效率的特点。结果表明,随生育进程的推进,小麦叶片谷氨酰胺合成酶活性、游离氨基酸和可溶性蛋白含量均呈先升后降的趋势,全氮含量则逐渐下降,在各时期深松处理的这些指标均显著高于旋耕和常规耕作处理,且在后期维持较高水平。深松处理通过营养器官花前贮存氮素向籽粒的高转运以及花后氮素的高吸收、高贡献,获得成熟期较高的籽粒氮素积累量和分配比例;虽然旋耕处理的转运氮对籽粒氮素的贡献率较高,但其氮素转运量、转运效率和花后吸收氮量较低,成熟期籽粒的氮积累量和分配比例在三种耕作方式中最低,茎秆和穗轴+颖壳的分配比例反而最高。深松处理较其余二处理能显著提高小麦籽粒产量和蛋白质含量、氮素吸收效率、氮肥回收效率、氮肥偏生产力和氮素产投比。因此,深松能有效促进砂姜黑土区小麦的氮素同化能力,延长叶片功能期,提高氮素利用效率,促进小麦产量与品质的形成。     

晚播条件下施氮量对稻茬小麦氮素吸收及产量的影响

为给安徽省江淮稻麦轮作区域晚播稻茬小麦高产栽培的氮肥合理施用提供依据,选用当地主栽品种扬麦18和皖垦麦076为试验材料,设置5个施氮水平(0、90、180、270和360 kg·hm~(-2)),分析施氮量对晚播小麦氮素积累与分配、糖氮比、氮素同化酶活性及产量的影响。结果表明,增施氮肥能显著提高小麦各器官的氮积累量以及营养器官花前贮存氮素转运量、转运效率和转运氮素对籽粒氮素的贡献率,氮素收获指数随着施氮量的增加而降低。随施氮量的增加,小麦各生育时期不同器官的糖氮比值显著降低。小麦的氮素分配比例在生育前期以叶片最高,成熟期籽粒中氮素分配比例显著高于其余部位,而小麦的可溶性糖分配比例在生育前期以茎鞘最高,成熟期籽粒较高。在0～270 kg·hm~(-2)施氮量范围内,增施氮肥后,两个小麦品种的硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶活性均显著提高,穗数、穗粒数和籽粒产量均明显增加。继续增加施氮量至360kg·hm~(-2)时,氮素同化酶活性和产量无显著变化,说明施氮过多对小麦氮素同化和产量无益。土壤氮贡献率、氮肥农学利用效率和氮素偏生产力均随施氮量增加而降低。推荐江淮区域稻茬小麦晚播条件下适宜施氮量为180～270kg·hm~(-2)偏下限,可兼顾高产及氮素高效吸收和利用。     

不同氮利用率粳稻品种的碳氮积累与转运特征及其生理机制

【目的】探明不同氮利用率水稻品种的氮素积累与转运特征及其机制。【方法】2个氮高效品种(武运粳30号和连粳7号)和2个氮低效品种(扬粳4038和宁粳1号)种植于大田,设置2个施氮量：全生育期不施氮(0N)和全生育期施氮180kg/hm²(180N),比较分析了不同氮利用率粳稻品种干物质生产、氮素积累与转运差异及其机制。【结果】与氮低效品种相比,氮高效品种具有较高的产量、氮肥利用率、总颖花量和结实率,较高的花前干物质转运量和花后干物质积累量,分蘖至穗分化始期和抽穗至成熟期较高的净同化率和作物生长率,抽穗期较高的糖花比,灌浆期较高的籽粒库活性、籽粒中脱落酸与1-氨基环丙烷-1-羧酸含量的比值和茎鞘中较高的非结构性碳水化合物的转运和蔗糖合成相关酶活性以及蔗糖转运蛋白基因的表达量,抽穗后较高的氮转运、氮素吸收量,灌浆期较高的比叶氮含量、叶片中细胞分裂素含量、氮代谢酶活性以及氮素转运相关基因的表达量。【结论】氮高效品种穗分化前和抽穗后较高的物质生产效率以及灌浆期较高的碳氮转运与积累是产量和氮肥利用率协同提高的重要机制。     

花前氮亏缺对水稻叶片氮代谢酶活性的影响

以籼型杂交稻中浙优1号和籼粳型杂交稻甬优12为材料,试验分析了花前不同时期氮亏缺处理对水稻叶片氮代谢酶活性的影响。结果表明,花前氮亏缺导致植株上3叶氮浓度、NR、GS、GOGAT、GOT和GPT酶活性大幅下降,GDH活性显著增长,且各叶位对花前氮亏缺敏感度总体上表现为剑叶倒2叶倒3叶;破口期亏氮对籼型杂交稻中浙优1号上3叶氮同化酶活性的影响远小于减数分裂期处理,与之相比,籼粳杂交稻甬优12对破口期亏氮胁迫仍较敏感,表明中浙优1号植株氮代谢酶的亏氮敏感性由减数分裂期至破口期逐步下降,对土壤速效氮的需求同步降低,甬优12则对土壤供氮存在更高需求。     

施氮时期对专用小麦干物质和氮素积累、运转及产量和蛋白质含量的影响

为了明确施氮时期对小麦花后干物质和氮素积累与运转的影响及其与产量和品质的关系，在大田高产条件下，研究了不同追氮时期对二个专用小麦品种开花前后氮素同化、运转和蛋白质含量的影响。结果表明，拔节和孕穗期追氮均提高了小麦产量和籽粒蛋白质含量，但过迟追氮不利于产量和蛋白质含量的同步提高。不同追氮处理显著提高了徐麦26花后氮素积累量，降低了营养器官贮存氮素向籽粒的转运，但提高了淮麦18营养器官贮存氮素向籽粒的转运。相关分析表明，徐麦26籽粒蛋白质合成所需氮素主要来源于花后氮素同化，而淮麦18则更多地依赖于开花前贮存氨素的再动员与分配。     

高浓度CO2条件下水稻叶片氮含量下降与氮代谢关键酶活性的关系

利用FACE（Free Air Carbon Dioxide Enrichment）平台技术,研究了低氮（125 kg/hm2,以纯N计）和常氮（250 kg/hm2）水平下,高浓度CO2（周围大气CO2浓度+200 μmol/mol）对水稻不同生育期功能叶N代谢关键酶活性的影响。结果表明,高浓度CO2提高了叶片硝酸还原酶和蛋白水解酶的活性,两者在常N下的响应程度大于在低N下的响应程度;高浓度CO2降低了低N下叶片谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶（NADH GDH）活性,常N水平下酶活性的下降趋势得到改变或缓解。由此可见,高浓度CO2条件下NO3-转化为NH4+加速,而NH4+进一步同化为有机N却受阻,而且,由于后期蛋白水解加速,将进一步加剧叶片N含量的下降。这是水稻叶片N含量下降的内在因素。而增施N肥,有利于同化酶的表达,降低叶片蛋白水解酶活力,从而缓解叶片N含量的下降。