应用RACE法克隆雷竹笋PAL基因及序列分析

应用RACE法,克隆获得了雷竹笋PAL基因的全长序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明:雷竹笋PAL基因的开放阅读框长度为2103 bp,共编码701个氨基酸,其中具有1个保守的活性位点Ala-Ser-Gly(A-S-G);在PAL蛋白的二级结构中含有大量的α螺旋和β折叠,其三级结构模型为一个带柄的圆锥形。构建的PAL基因核苷酸序列进化树结果显示雷竹与毛竹、绿竹的亲缘关系最近,与小麦、大麦、水稻、佛肚竹的亲缘关系较近,与玉米、高粱的亲缘关系较远。     

不同保鲜处理对雷竹笋PAL活性的影响

以雷竹笋为材料,测定不同处理方式对雷竹笋PAL活性的影响。分别用不同浓度(1%,1.5%,2%)壳聚糖涂膜、不同浓度(50,100 mg·L-1)赤霉素、不同温度(5,0℃和常温)和不同剂量(4,8,12 k Gy)辐照进行处理,然后测量雷竹笋PAL活性。结果表明:4组处理中分别以1.5%壳聚糖涂膜、100 mg·L-1赤霉素、0℃和8 k Gy辐照处理对PAL活性的抑制效果较好。在雷竹笋保鲜中对其分别以1.5%壳聚糖涂膜、100 mg·L-1赤霉素、0℃和8 k Gy辐照进行处理可抑制雷竹笋PAL活性,延缓雷竹笋老化,从而延长其保鲜期。     

RACE法克隆湖羊SPLUNC1基因及序列分析

通过克隆湖羊短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)基因的cDNA序列,为研究其蛋白的结构和功能奠定基础。参照GenBank上牛、山羊的SPLUNC1基因的cDNA序列,设计简并引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,测序后进行拼接,获得湖羊SPLUNC1基因cDNA全长序列,并对序列进行分析。结果表明:克隆的湖羊SPLUNC1基因cDNA序列全长为1 091bp(GenBank登录号KJ749828),其中开放阅读框为768bp,共编码255个氨基酸。构建的氨基酸进化树结果显示湖羊SPLUNC1与预测绵羊的氨基酸同源性最高,山羊次之。     

桑树白藜芦醇合酶基因全长克隆及序列分析

根据已知的其他物种白藜芦醇合酶cDNA保守序列设计引物,用RT－PCR技术从桑葚中扩增获得白藜芦醇合酶基因部分cDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列,并拼接得到完整的1442 bp白藜芦醇合酶基因。经序列分析发现,桑树白藜芦醇合酶基因开放阅读框长1170 bp,编码389个氨基酸,氨基酸序列含有芪合酶家族特征信号区GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR;该基因与花生芪合酶基因的核苷酸序列同源性高达82．82％,氨基酸序列的同源性高达87．15％。     

文昌鸡PRL基因的克隆及序列分析

为研究文昌鸡催乳素基因的分子生物学特性和就巢机理,提取文昌鸡全血总DNA,利用特异性引物PCR技术获得文昌鸡PRL基因,将其克隆至pGM-T载体上,并测序分析.结果表明,文昌鸡PRL基因与GenBank 上已公布的白来航、泰和丝羽乌骨鸡核苷酸序列同源性分别为93.3%和93.5%,而氨基酸序列同源性均为89.6%;与其...     

蕙兰Actin基因的克隆及序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参.为研究其他基因的调控机制或外源基因在蕙兰中的相对表达提供内参,根据GenBank已经登录的肌动蛋白(Actin)基因的同源核苷酸保守序列,设计简并引物,利用RT-PCR的方法,以蕙兰花蕾期的花葶为材料,克隆了4个Actin基因片段.序列分析结果表明,4个Actin基因片段长度均为1 062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的标记位点:肌动蛋白(YVGDEAQs.KRG和WISKaEYDE)和肌动蛋白类似物(LLTEApLNPkaNR).各片段之间同源性高达95.97％,经BLAST分析,与文心兰同源性可达94％.其氨基酸序列与萼脊兰(AED94091.1)和蝴蝶兰(AAF71265.1)同源性达99％.得到的4个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为CfACT1、CfACT2、CfACT3和CfACT5,并在GenBank注册,登录号分别为JN177718、JN177719、JN177720和JN177721.     

樱桃CBF基因的克隆及序列分析

CBF(CRT/DRE-binding factor)基因是一种低温响应转录因子基因,CBF蛋白能够与很多低温相关基因的启动子结合,使其表达,从而增强植物抗冷能力。本研究利用已经公布的CBF序列的保守区设计特异引物,对樱桃砧木吉塞拉6号的cDNA进行扩增,成功获得CBF的全长序列。序列分析结果表明,其开放阅读框为723 bp,编码240个氨基酸,具有典型的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。氨基酸序列同源性分析表明,该CBF与蔷薇科植物同源性较高,与其他科属植物同源性较差。     

木豆Actin基因片段的克隆及序列分析

根据大豆Actin基因的保守序列设计一对引物Primer 1和Pri mer 2,以木豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PMD-18T载体。阳性克隆经PCR检测后测序,序列分析结果表明,该片段长302bp,编码100个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在89%以上,其中与大豆的同源性达94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上。     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA,cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明,乳糖酶基因组DNA序列长3368bp,其中含有8个内含子,cDNA编码区长2967bp,共编码988个氨基酸,氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较。     

桃PGIP基因及cDNA的克隆及序列分析

通过PCR扩增了桃的PGIP基因及eDNA序列,并进行了序列之间的比对及分析。结果表明,桃的PGIP基因全长1092bp,而其cDNA序列只有1045bp,PGIP基因中含有一段长147bp的内含子,且内含子符合GT-AG规律。这与其他核果类植物的PGIP基因构成基本相同。其基因序列与GenBank中已登录的3个桃以及其他核果的序列比对,其同源性达92％～99％;与苹果、梨和大桉的同源性分别为85％、84％和8．4％。     

雷笋膳食纤维的制备工艺及其特性研究

以雷笋笋肉及加工后的下脚料笋壳等为原料,探讨了制取雷笋膳食纤维的最佳工艺条件。通过正交试验设计,采用绿色木霉发酵法制备雷笋膳食纤维,并对其化学成分、持水力、溶胀性、对重金属束缚能力等特性进一步研究。结果表明:最佳发酵条件为8%的接种量,于32℃,pH为7.0条件下培养48 h;产品的膳食纤维含量为85.23%,可溶性膳食纤维为30.43%,持水力和溶胀性分别达到7.82 g/g和689 mL/g,对重金属Cd2+和Pb2+的最大束缚量分别为38.8μmol/g和37.4μmol/g。     

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）,分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL）,是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。     

早竹竹叶蛋白的微波提取工艺优化

该文以早竹竹叶为研究对象,p H7.8的磷酸缓冲溶液为提取剂,采用微波提取法,并用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量,在料液比、提取时间、提取温度、微波功率等单因素试验的基础上,进行L9(34)正交试验设计,优化了微波提取早竹竹叶蛋白的工艺参数。结果表明:各因素对早竹竹叶蛋白质的提取率的影响顺序依次为:微波时间微波温度微波功率料液比。微波提取早竹竹叶蛋白的最佳工艺条件为:料液比为1∶25,微波时间为8min,微波温度为54℃,微波功率为500W,在此最佳条件下,提取率为8.07%。     

光箨篌竹笋的营养成分分析

本研究以光箨篌竹竹笋为试验材料,对其营养成分、矿质元素含量、氨基酸含量进行分析。结果发现,其含有纤维素等营养成分,丰富的矿质元素以及17种蛋白质水解氨基酸,是一种食味较好,营养丰富的绿色蔬菜,可加以适当发展。     

蜡梅结瘤素基因CpNOD的克隆与表达分析

根据已构建的蜡梅cDNA文库中得到的片段,通过cDNA末端克隆得到了一个早期结瘤素基因,命名为Cp-NOD(GenBank登录号:JQ622290),该基因cDNA序列全长611个碱基,包含一个71bp 5-UTR区,一个333bp的开放阅读框ORF和一个207bp的3-UTR区,该基因由111个氨基酸组成,其中丙氨酸组分为多,占18.2%,序列比对分析表明,CpNOD具有典型的蛋白质家族ENOD93特征,属于ENOD93家族早期结瘤素蛋白.实时荧光定量PCR表达检测显示,CpNOD在蜡梅根、茎、花器中都有表达,其中以花中瓣表达最高;在花的不同阶段表达结果是从萌动期、花蕾期、盛开期到衰败期,表达量呈正相关,以衰败期表达量最高.转录表达分析结果推测,CpNOD在蜡梅的开花生理和氮元素响应方面起着积极作用.     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆和序列分析及其基因表达

采取三元杂交猪的外周血,提取单核细胞总RNA,采用RT-PCR克隆猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA(GenBank登录号为DQ108393)。以pcDNA3.1(-)为质粒载体,构建猪GM-CSF基因真核表达质粒pGM-CSF,对克隆片段进行测序,并进行不同物种间同源性的比较。将重组质粒转染COS-7细胞,Western blotting鉴定表达蛋白的特异性。序列分析表明,GM-CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸和大部分信号肽,与用作PCR引物设计的参考序列比较,其核苷酸的同源性为97.5%,氨基酸的同源性为95.1%,同绵羊、人、牛、小鼠和犬的GM-CSF序列比较,其核苷酸的同源性分别为86.2%、80.5%、81.7%、69.7%和81.8%,氨基酸的同源性分别为78.5%、71.3%、70.3%、55.9%和71.5%。Western blotting证实目的基因可以在真核细胞中特异性的表达GM-CSF蛋白。以上结果表明,猪的GM-CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用GM-CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。     

猪Ob-Rb基因的克隆与分析

[目的]采用RT-PCR法克隆与分析瘦素受体06-Rb cDNA序列。[方法]从160日龄初情期的苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA．根据GenBank中猪06．RbmRNA全序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）进行cDNA扩增,获得1条343bp的片段,将PCR产物克隆于pGEM—Teasy载体后进行测序分析。[结果]用紫外分光光度计检测所提取的RNA质量,0D260／OD280=1.9,证明所提RNA的质量较好,无降解和蛋白质污染;用1％的琼脂糖检测所提RNA,有3条清晰的条带,分别是28S、18S、5S,28S与18S浓度比约为2：1．说明所提的RNA的完整性较好。所获D6-RbcDNA序列用Blast程序与在GenBank中发表的猪06-Rb cDNA序列（AF092422）比较表明,其同源性为100％,说明所扩增的序列是正确的。[结论]该研究为进一步探索Ob-Rb基因组织表达和作用机理奠定了理论基础。