NtMYC1a转录因子的克隆与功能初步分析

从烟草根系中克隆NtMYC1a基因,构建表达载体并在烟草中瞬时表达,探讨了NtMYC1a转录因子在烟碱生物合成中的作用。转基因烟草中的NtMYC1a表达显著升高,表明成功构建了NtMYC1a表达载体并转化了烟草;转基因烟草中的PMT表达量显著升高,表明NtMYC1a能够正调控烟碱的合成;茉莉酸与干旱处理烟草后,检测到NtMYC1a和PMT的表达量显著升高,表明在茉莉酸、干旱促进烟碱合成的生物学过程中,NtMYC1a具有正调控的功能。     

转录因子NtMYC2 b参与烟草烟碱含量杂种优势形成的机制研究

为探讨bHLH转录因子家族成员MYC2b基因与烟叶中烟碱含量及烟碱含量杂种优势表现的相关性,利用RT-qPCR分析NtMYC2b基因与烟碱合成途径关键酶基因的表达,测定烟碱含量和烟碱杂种优势表现。结果表明,移栽后80 d,NtMYC2b在烟草亲本GDH88和巴斯玛根部的表达量较移栽后66 d上调,其根和叶中烟碱含量增加,杂交种根中NtMYC2b、鸟氨酸脱羧酶基因(ODC)、精氨酸脱羧酶基因(ADC)、N-甲基转移酶基因(PMT)、N-甲基腐胺氧化酶基因(MPO)的表达量相对于亲本平均表达量均明显上调,且除MPO外,NtMYC2b与ODC、ADC、PMT、QPT(喹啉酸磷酸核糖转移酶基因)在强优势组合VA116×巴斯玛中的相对表达量均明显高于弱优势组合VA116×GDH88,根和叶中烟碱含量及其杂种优势表现也具有相同的趋势,表明NtMYC2b参与了烟碱的合成,还可能参与了烟碱含量杂种优势的形成。相关性分析表明,在亲本根部,NtMYC2b表达量与PMT表达量呈显著正相关;在杂交种根部,NtMYC2b表达量与ADC、MPO表达量呈显著正相关;在杂交种叶片中,NtMYC2b表达量与烟碱含量杂种优势呈显著正相关,PMT表达量与ODC、ADC表达量均呈显著正相关。关键酶基因启动子序列分析表明,ADC中含有1个MYC结合位点和1个G-box元件;PMT中含有7个MYC结合位点和1个G-box元件。推测NtMYC2b可能通过与ADC、PMT的顺式元件MYC结合位点或G-box元件特异性结合调控ADC、PMT的表达,进而促进烟碱的合成,且NtMYC2b还参与了烟碱含量杂种优势的形成。     

甘草MYB转录因子GlMYB10的克隆与表达分析

根据甘草悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导前后的转录组测序结果,筛选到1个响应MeJA诱导的MYB转录因子基因,通过克隆该基因片段并进行序列分析确定该基因编码1个甘草MYB转录因子,将其命名为GlMYB10。该基因开放阅读框全长为1 172 bp,编码产物包含340个氨基酸,对其编码产物的基本理化性质、亲水性和疏水性、保守结构域等方面进行了生物信息学分析和预测,对GlMYB10基因编码产物的氨基酸序列进行聚类分析。结果表明,其与木豆中MYB类转录因子的同源性最高。应用qRT-PCR分析该基因的表达水平发现,GlMYB10基因在甘草悬浮细胞受MJ诱导后的表达量明显高于未诱导组,并且诱导9 h后表达量最高。通过对GlMYB10基因进行克隆与表达分析,为探索该基因在甘草悬浮细胞黄酮类化合物生物合成中的调控作用奠定基础。     

ERF转录因子StERF1的生物信息学分析

从生物信息资源中寻找有重要功能的新ERF基因,命名为StERF1,用生物信息学方法对其主要理化性质和功能进行分析预测,为下一步的试验策略提供参考。StERF1编码一个由247个氨基酸组成的相对分子质量为27203.9的蛋白质,该蛋白具有一个由58个氨基酸残基组成的保守ERF结构域(112～169),在N端有一个可能起激活作用的酸性结构域,在C端有一个可能作为核定位信号(NLS)的碱性结构域,它可以结合GCC-box顺式作用元件,推测StERF1是一个定位在核内发挥转录激活作用的ERF转录因子。它可能在调控植物乙烯信号途径、生物胁迫或非生物胁迫应答过程发挥重要作用。     

植物MYC转录因子的克隆与功能研究进展

MYC转录因子属于植物bHLH类转录因子家族,为该家族中研究较多的转录因子.综述了不同植物分离克隆的MYC转录因子的结构与特性,分析了其在植物的生长发育、抗逆反应、次生代谢产物合成、激素信号途径中起着重要的作用,为MYC转录因子在不同植物基因工程和代谢工程中改造应用,提高非生物胁迫耐受性以及药用活性成分的产量等研究提供参考.     

核桃油脂合成转录因子JrWRI1基因的克隆及生物信息学分析

为研究核桃果实油脂合成与积累的分子调控机理,以核桃果实种仁cDNA为模板克隆得到油脂合成关键转录因子JrWRI1基因,其cDNA序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸。通过对其结构特征、生物学特性进行分析,发现该基因编码蛋白属于AP2/ERF转录因子超级家族,具有特异的DNA结合序列,调节生物合成和代谢过程,定位于细胞核中,符合转录因子行使功能的特点。并构建了JrWRI1超表达重组载体,为进一步研究JrWRI1在核桃果实油脂合成与积累过程中的功能奠定基础,也为利用分子手段加快高油核桃新品种的选育提供参考。     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

烟草DREB转录因子新基因的克隆与功能分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE),从烟草中克隆到1个新的烟草DREB基因,命名为NbDREB2a.序列分析表明该基因全长1191 bp,编码330个氨基酸,具有典型的DREB转录因子保守的AP2结构域.实时RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,受低温、干旱和高盐诱导.酵母转录激活实验证明,该基因可以特异性结合DRE顺式作用元件,并能激活报告基因的表达.为了研究该基因在植物抗逆反应中的功能,利用农杆菌介导法,将该基因转化到模式生物拟南芥中,筛选到了单拷贝插入的、纯合的拟南芥株系;对获得的转基因拟南芥进行干旱及高盐处理,结果表明,与对照相比,超量表达该基因能够明显地提高拟南芥对干旱及高盐的抗性.     

辣木转录因子家族初步鉴定与分析

转录因子在转录水平上激活或抑制基因的表达,在植物生长发育、维持正常生理活动和响应内外部刺激等方面具有重要作用。随着辣木基因组组装的完成,本研究通过生物信息学的方法,对辣木中转录因子家族进行鉴定与初步分析,结果共筛选到1502个转录因子,分属86个家族。同时以拟南芥为参照,鉴定了43个受正选择作用的转录因子,这些正选择基因涉及植物生长发育的各个时期,与植物抗病、环境胁迫密切相关。对辣木HSF蛋白研究表明大部分蛋白的Hsf结构域相对保守,与拟南芥HSF家族蛋白构建系统发育树,发现辣木Hsf基因的分类与进化在一定程度上具有相关性。研究结果将为辣木的生长发育及环境胁迫应答机制提供分子基础。     

烟草转录因子基因NtGRAS-R1的克隆与功能分析

为了分析NtGRAS-R1的生物学功能,在NCBI上BLAST植物的EST数据库拼接获得Nt-GRAS-R1的全长序列;根据该序列设计特异引物,利用PCR方法从烟草根系cDNA 中扩增Nt-GRAS-R1,将其连接到pS1300表达载体上,采用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥,采用RT-PCR法检测转基因拟南芥植株;获得稳定转基因拟南芥后观察生长性状,并用qPCR方法检测At-CLV3基因的表达情况。结果显示,NtGRAS-R1基因属于HAM亚家族,编码508个氨基酸;观察发现,转基因拟南芥植株根长和根体积明显大于野生型;qPCR结果表明,转基因拟南芥AtCLV3的表达量明显低于野生型拟南芥。初步表明NtGRAS-R1参与根系生长发育调控过程。     

棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站（http://smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时（一对真叶期）,分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis,DPA）纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现,GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

紫花苜蓿NAC类转录因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因MsNAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解MsNAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿MsNAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建MsNAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建pBI121-MsNAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达MsNAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】MsNAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 kD,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙CsNAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明MsNAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsNAC2受250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000、0.1 mmol·L^-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且MsNAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在NaCl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因MsNAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达MsNAC₂烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。     

栽培小麦Brock中转录因子基因WRKY的克隆与表达分析

WRKY类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用。本研究在小麦中分离到一个WRKY类转录因子基因Ta WRKY,该基因序列全长1 242 bp,推测编码蛋白含354个氨基酸,相对分子量为86 k D,理论等电点为4.96,与小麦中WRKY8序列同源性为97%。进化树分析表明,Ta WRKY与小麦中WRKY8亲缘关系较近。基因的诱导表达模式分析显示,Ta WRKY受白粉菌诱导,染菌8 h达到表达最高值。上述试验结果初步说明,Ta WRKY基因在小麦抵抗白粉菌侵染过程中可能发挥着重要作用。     

烟草中NAC类转录因子基因的克隆及分析

 【目的】克隆烟草NAC类转录因子基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究NAC类转录因子对烟草打顶后根系的生长发育与烟碱生物合成之间的关系奠定基础。【方法】采用电子克隆结合RT-PCR获得烟草NtNAC-R1全长cDNA序列,并进行生物信息学分析,用pRESTB原核表达系统进行该基因的原核表达。分别采用RT-PCR和Northern杂交对烟草打顶前、后根尖组织中NtNAC-R1的表达模式进行分析。【结果】烟草NtNAC-R1开放性阅读框架长度为936 bp,编码311个氨基酸,具有NAC转录因子家族典型的保守结构域。系统进化分析表明,该基因与矮牵牛NAC亲缘关系较近,属茄科植物特异NAC家族,在原核细胞中具有表达活性。该基因在烟草根中的表达水平最高,在烟草打顶后2—4 h表达水平下降,随后上升。【结论】从烟草根尖组织中克隆了一个NAC转录因子基因NtNAC-R1,该基因在根系中具有高水平表达,在烟草打顶后2—4 h表达水平显著降低,具有响应烟草打顶所导致的信号传递作用。     

陆地棉bHLH转录因子GhMYC4基因的克隆及功能分析

通过电子克隆技术从陆地棉中分离了一个Gh MYC4基因(Gen Bank登录号:KF751654),该基因编码的蛋白属于b HLH类转录因子。生物信息学分析结果显示:该基因完整开放阅读框有1 650 bp,编码549个氨基酸。Gh MYC4蛋白的N-端具有MYC蛋白家族特有的b HLH-MYC-N保守结构域,C端具有高度保守的DNA结合域即b HLH结构域。同源比对和系统进化树分析结果显示Gh MYC4蛋白与陆地棉b HLH转录因子和可可b HLH转录因子的亲缘关系最近,与其他物种的MYC2家族成员具有很大的相似性。通过Real time-PCR检测该基因的组织表达特异性,结果显示该基因在陆地棉的根部和叶片中高效表达,纤维中微量表达。在拟南芥原生质体中进行该基因的瞬时表达,证实了Gh MYC4蛋白定位于细胞核。转Gh MYC4的拟南芥受到高盐和干旱胁迫后相比于对照在表型上表现出很好的抗旱耐盐性能,其叶片相对含水量、可溶性糖含量及脯氨酸含量显著高于对照,MDA含量显著低于对照。该结果为培育抗旱耐盐棉花新品种提供了新的基因来源。     

向日葵逆境应答转录因子DREB的克隆与表达分析

DREB类转录因子在作物抵御逆境胁迫上起重要作用,利用该类基因改良作物抗逆性具有重要意义。研究利用同源克隆方法在6份向日葵资源中均分离到1个DREB类转录因子基因。该基因序列全长945 bp,推测编码蛋白含314个氨基酸,与NCBI中该基因序列同源性均达到99%以上,不同材料之间该基因序列存在单碱基突变,突变位置不一致,且未发现与耐旱性有明显相关性。表达分析显示,6份向日葵材料根、茎和叶中的DREB基因均受干旱、盐害和低温的诱导,作出表达量上调的应答,胁迫超过一定时间,表达量出现下降的趋势。所有材料叶中DREB基因的上调幅度明显高于根和茎中,低温胁迫后的表达上调量要明显低于干旱和盐害胁迫下的表达上调量。各材料根、茎、叶中DREB的表达量与耐旱性未发现有明显相关性。     

棉花转录因子基因GhMS3的克隆及其启动子功能的鉴定

【目的】从棉花无短绒突变体GZnn中分离棉纤维发育相关的转录因子,并对其转录激活功能和表达模式进行初步分析。【方法】通过RACE(rapid amplification of the cDNA ends)和染色体步行(genome walking)技术,获得GhMS3的cDNA序列及基因组DNA序列。利用生物信息学方法对获得的DNA序列及推定的氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交系统验证GhMS3蛋白的转录激活功能,运用GUS组织化学染色法在转基因烟草中分析该基因的表达模式。【结果】获得GhMS3的基因组DNA以及上游1174bp的启动子序列。氨基酸序列比对发现GhMS3是R2R3 MYB转录因子。酵母试验表明,GhMS3蛋白具体外转录激活功能,C端体外转录激活功能较强,在PGhMS3:GUS转基因烟草中,GUS主要在表皮毛、根毛以及细胞分裂旺盛区域表达。【结论】从棉花无短绒突变体GZnn中分离到的R2R3 MYB转录因子GhMS3,具有组织特异性表达模式并且其编码蛋白具有体外转录激活功能,是否参与植物表皮细胞分化有待于进一步研究。