一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20 μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体增殖液中的噬菌体核酸进行琼脂糖凝胶电泳,确定其基因组片段大小;最后用常规方法测定噬菌体的滴度、最佳感染复数、一步生长曲线,并通过比较加入噬菌体液前后青枯雷尔氏菌菌液的OD₆₀₀值变化测定其对温度、pH、紫外线、氯仿的敏感性。【结果】分离并纯化出了一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体,命名为∈RS-1, 噬菌斑为圆形,清晰透明,边缘光滑,直径1-2 mm,经电镜观察其形态为蝌蚪状,头部为二十面体的立体对称,直径约为94 nm,并有一带伸缩尾鞘的长尾大约为27 nm×100 nm,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目（Caudovirales）,肌尾噬菌体科(Myoviridae)的裂解性噬菌体,核酸性质为dsDNA;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析至少可以观察到25条蛋白条带,相对分子质量在10-100 kD,说明其蛋白外壳至少含有25个结构蛋白;将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示其条带大于48 kb,符合肌尾噬菌体科基因组大小范围（31-317 kb）;生物学特性的测定显示该噬菌体对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数为0.01;其吸附和感染青枯雷尔氏菌时的潜伏期约为30 min,爆发期约为80 min,裂解量约为156;该噬菌体的裂解活性在28℃时最高,在28-50℃均较强,但在温度超过60℃后活性基本丧失;其对酸碱的耐受力较强,在pH 3-8的范围内均有较强的裂解活性,当pH值超过9后活性开始降低;其对紫外线有一定的耐受能力,经紫外线照射0-9 min后裂解活性依然较强,12 min后活性开始下降,21 min后活性基本丧失;其对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。【结论】分离到了裂解性的青枯雷尔氏菌噬菌体,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,经过测定其各项生物学特性可知其潜伏期较短,裂解能力较强,具有很好的杀菌效果,且其裂解活性持续时间长,并能在不同温度、不同酸碱性的环境内有较强的适应能力,具有开发为抗青枯雷尔氏菌菌剂的潜力。     

兔源大肠埃希菌噬菌体分离鉴定与生物学特性研究

对浙江省某兔场腹泻病兔进行病原分离鉴定,经革兰氏染色和PCR鉴定,分离出致病性大肠埃希菌1株,命名为ZJE1株。ZJE1株对链霉素、环丙沙星敏感。以ZJE1株为宿主菌,分离纯化出噬菌体4株,分别命名为ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5,并对其生物学特性、形态与结构特征进行研究。结果显示,4株噬菌体分离株均由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成,均属于肌尾噬菌体科。采用双层平板法测定噬菌体分离株的宿主谱、最佳感染复数、pH稳定性、热稳定性和一步生长曲线。结果显示,ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5具有宿主特异性,在37~55 ℃的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3在pH值7的条件下可保持良好活性,ZRP4、ZRP5在pH值5~7的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3、ZRP5的潜伏期为11~19 min,均能在体外裂解ZJE1株。研究成果可为应用噬菌体治疗兔大肠埃希菌病提供研究基础与数据支持。     

肠炎沙门菌噬菌体vB_SalP_QS的生物学特性及治疗小鼠沙门菌肠道感染的研究

为探索针对耐药沙门菌的噬菌体治疗方法,以沙门菌SE-21为宿主菌,从污水中分离得到一株烈性噬菌体并命名为vB_SalP_QS。在鉴定vB_SalP_QS生物学特性的基础上,对vB_SalP_QS和vB_SalP_SE29混合噬菌体治疗由沙门菌SE-21引起小鼠肠炎的治疗效果进行评价。结果表明：1）电镜观察可见该噬菌体属于有尾病毒目（Caudovirales）,其效价为8×10⁸ PFU/mL。2）vB_SalP_QS的最佳感染复数（MOI）为0.01,潜伏期为40 min,裂解期为50 min。温度为4~60 ℃具有较好的活性,在pH 4~pH 10范围内非常稳定。平板点滴法试验表明vB_SalP_QS可以裂解17株沙门菌,裂解率为44.7%。3）噬菌体vB_SalP_QS的全基因组测序分析显示,噬菌体vB_SalP_QS全长42 293 bp,GC含量为49%,共含有72个开放阅读框,且不含有溶源性、毒力因子及整合酶基因。4）小鼠体内治疗试验显示,宿主菌SE-21对小鼠最小致死量为5×10⁸ CFU/mL,感染小鼠经vB_SalP_QS （100 μL 1×10⁷ PFU/mL）和vB_SalP_SE29 （100 μL 1×10⁷ PFU/mL）混合治疗后存活率为100%,单独用vB_SalP_QS治疗组 （200 μL 1×10⁷ PFU/mL）的小鼠存活率为80%,单独用vB_SalP_SE29治疗组（200 μL 1×10⁷ PFU/mL）的小鼠存活率为70%,对照组全部死亡。5）病理组织观察表明,混合噬菌体可以有效杀灭沙门菌SE-21的同时,还能更好地保护小鼠肠绒毛,可显著提高感染SE-21的小鼠存活率。综上,噬菌体vB_SalP_QS具有良好的酸碱稳定性、热稳定性以及安全性,混合噬菌体联合治疗效果优于噬菌体单一治疗。本研究为噬菌体制剂治疗沙门菌感染提供了重要依据,也为混合噬菌体鸡尾酒疗法的临床应用奠定基础。     

5株乳酸菌的分离鉴定与生物学特性研究

从泡菜和仔猪粪便中分离出5株乳酸菌,分别命名为RS、RB、RFT、RST、RO,结合细菌形态学、生理生化特性和16S rRNA序列同源性分析进行鉴定,并对其特性进行了研究.结果表明RS菌株为植物乳杆菌,RB、RO菌株为粪肠球菌,RVI、RST为屎肠球菌.其中RS菌株具有较好的耐酸性、一定的胆盐耐受力,对温度敏感;RB、RPT、RST、RO菌株对模拟肠液具有较强的耐受力,45-55℃处理30 min不影响其生长;5个菌株对大肠杆菌O<,157>和沙门氏菌的抑菌率均达到98%-100%,可作为优良的益生菌候选菌.     

广西猪源沙门菌的分离·鉴定和耐药性研究

[目的]了解广西地区猪源沙门菌的流行情况、耐药现状及致病力情况。[方法]从广西不同地区11个规模猪场采集99份病料,进行细菌的分离、菌体形态特征观察以及生化鉴定,对分离菌进行常用抗生素药物敏感试验,最后对分离株进行小鼠致病性试验。[结果]从99份病料里分离到21株沙门菌,分离率21%。药敏试验表明,分离菌株对阿米卡星、头孢噻肟、氨曲南、左氟沙星具有较高的敏感性,对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明等产生较高的耐药性。致病性试验表明9株分离菌株可导致小白鼠死亡,致死率为43%。[结论]分离菌株存在较严重的耐药现象及较强的致病性。该研究为该地区有效控制沙门菌病的发生以及兽医临床上的合理用药提供可靠的理论依据。     

生物制品公司周边环境中2株大肠杆菌噬菌体的分离鉴定

为了检测生物制品公司周边环境中噬菌体的种类及含量,以大肠杆菌(CMCC44102)为宿主菌,对生物制品公司污水处理厂污水样本中的噬菌体进行了分离纯化,并对纯化样本的一般生物学特性进行了鉴定。实验分离获得了2株噬菌体ΦL和ΦS,ΦL噬菌斑直径为1~2mm,ΦS噬菌斑直径为0.1~0.3mm。2株噬菌体在电镜下形态极为相似,均可见明显头部和尾部结构,头部呈正多面体,直径约为33nm;尾部较短,长约21nm,可见爪刺样结构。ΦL与ΦS的一般生物学特性大多相似,前者效价为2.129×10~(10) PFU/mL,后者为2.5645×10~(10) PFU/mL;2株噬菌体的最佳感染复数均为10;在37℃及以下温度均具有良好的稳定性;且均对宿主菌,即大肠杆菌(CMCC44102)具有高度属特异性。一步生长曲线结果表明,ΦL的潜伏期和爆发期均显著短于ΦS,说明ΦL生长能力强于ΦS。上述结果表明,生物制品公司周边环境中存在大量噬菌体,并对一些重要工程菌具有高度特异性,应高度关注并防止其对生物产品质量产生影响。     

15株NDV地方株的分离鉴定与生物学特性

从1998~2002年河南省洛阳地区代表性新城疫发病禽群中分离鉴定了15株新城疫病毒(NDV),并对其生物学特性进行了研究。结果表明,15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制特性;对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制;对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT),1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉内接种的致病指数(IVPI)的测定证实,LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株,其余均为强毒株;弱毒株的血凝素热稳定性较好,属慢速血凝解脱型;强毒株的血凝素热稳定性差,属快速或中速血凝解脱型;所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log2的12日龄雏鸡攻毒试验结果表明,15个分离株中2个弱毒株可得到100%保护;13个强毒株中,LG-1-99,LR-1-98,LD-4-01和LD-3-00得到了70%~90%的保护,而其他9个分离株(LD-1-98,LD-2-99,LD-5-01,LD-7-02,LR-3-02,LW-1-02,LG-2-00,LA-1-99和LE-1-01)基本上得不到保护(0~20%),但所有得不到保护的试验组鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。     

羔羊源沙门菌的分离鉴定与药敏试验

为了解某地区规模化养殖场及散养户中引起腹泻死亡羔羊的沙门菌流行情况。采集2022～2023年规模化养殖场及散养等腹泻死亡羔羊的粪便、肛拭子及内脏等病料组织123份,采用细菌分离培养、形态学观察及生化鉴定试验对采集的123份病料组织进行沙门菌的分离鉴定,并采用K-B药敏纸片法对分离的菌株的进行耐药性分析。结果显示：从2022～2023年规模化养殖场及散养户中腹泻死亡羔羊的粪便、肛拭子及内脏等123份病料组织中分离得到78株沙门菌,其分离率为63.4%(78/123)。分离的78株沙门菌对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、新霉素、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶耐药性较高,耐药率分别为100.0%、97.4%、94.9%、83.3%、79.5%、66.7%;78株沙门菌对头孢噻呋、头孢噻肟、多西环素氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素、林可霉素等8种药物的耐药率为7.7%～29.5%之间,可以在临床中推广与应用。     

稀有放线菌噬菌体ΦSCU20的分离及其生物学特性的研究

以稀有放线菌小单孢菌40027菌株为指示菌,从土壤中分离得到1株新噬菌体,命名为ΦSCU20。在测试的9株放线菌菌株中,仅能感染小单孢菌40027菌株和A-M-01菌株。电镜观察显示噬菌体ΦSCU20由多面体的头部和尾部组成。噬菌体ΦSCU20生物学特性研究表明,噬菌体ΦSCU20形成噬菌斑时培养基中适宜的Ca2+和Mg2+浓度分别为8 mmol/L和20 mmol/L;噬菌体ΦSCU20在储存液中适宜的pH值为8;噬菌体ΦSCU20不耐高温,经40℃保温30 min后,其活力降低到48.65%,经60℃保温30 min后,则完全失活;噬菌体ΦSCU20基因组特性研究表明,该噬菌体的基因组为双链DNA,基因组大小约为65 kb。     

致病性凡隆气单胞菌的分离鉴定与生物特性

为弄清发病瓯江彩鲤的致病病源及其特征特性,采用鲜血琼脂培养基从发病瓯江彩鲤肝脏分离到1株革兰氏阴性杆菌(HX201006-1),经细菌形态学及培养特征观察,再作生化分析、16S rDNA序列分析和构建系统发育树进行分类鉴定,且对该菌株作了药敏特性和致病性试验.结果表明:分离菌株为凡隆气单胞菌温和生物型,该菌16S rDNA前546 bp与印度凡隆气单胞菌温和生物型AE-21株的亲缘关系最近,同源性为99%;调整含菌量为3×108CFU/mL以肌肉和腹腔注射感染试验动物,16 h致死小白鼠,46 h内5条异育鲫鱼全部死亡,67 h内5条鲤鱼全部死亡,该菌株具有较强的致病性;药敏试验中该菌对头孢噻吩、丁胺卡那、庆大霉素等9种药物敏感;对红霉素和复方新诺明中度敏感;对青霉素、四环素和O/129等9种药物均存在不同程度的耐药性.     

1型传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及生物学特性

为探究河南省汝州市某大型规模化养猪场育肥猪发生疫情的原因,对该猪场发病猪进行了细菌的分离鉴定和生物学特性试验。结果显示,从该猪场分离到传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)经鉴定为1型,对仔猪有较强毒力,有较好的免疫原性,免疫后对强毒的攻击提供完全的保护。药敏试验显示,对头孢哌酮、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛等药物敏感。     

蚕豆赤斑病病原菌分离鉴定及生物学特性研究

采用组织分离法进行病原物的分离、柯赫氏法则进行致病性测定,并利用真菌通用引物ITS1/ITS4和蚕豆葡萄孢特异性引物G3PDHfor/G3PDHrev进行基因组DNA扩增与序列分析,对甘肃省渭源县蚕豆赤斑病的致病菌种类进行研究。结果表明：该病原菌为蚕豆葡萄孢（Botrytis fabae）,系统发育树分析表明该病原菌与GenBank已报道的蚕豆葡萄孢属聚为一类。生物学特性测定表明,该病原菌菌丝生长最适培养基为PDA培养基,最适碳源和氮源分别为乳糖和酵母膏,最适温度为20 ℃,最适pH为8,对光照不敏感。     

杨木变色菌的分离鉴定及其生物学特性的研究

通过对杨木变色菌的分离鉴定,得到变色菌可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)和新月弯孢(Curvularia lunata),并对这两种变色菌的生物学特性进行了研究.结果表明,两种变色菌对强酸性条件比较敏感,最适pH生长范围均为5～8;可可球二孢在20～35℃生长较好,最适生长温度为30℃;新月弯孢在25、30和35℃时生长量差异不显著.光照能够促进两种变色菌的生长.     

一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

从土壤中分离筛选到一株具有广谱抗菌活性的拮抗细菌,命名为XZ-1。采用平板对峙培养法测定其抑菌活性,结果显示:XZ-1对大蒜叶枯病菌、草莓炭疽病菌等8种重要农作物病害的病原真菌均具有较强的拮抗活性,且抑菌带直径均大于10 mm。采用PCR扩增16S r DNA片段并用MEGA 6.0软件构建系统发育进化树,结果表明XZ-1与解淀粉芽孢杆菌16S r DNA序列KY828923聚为一簇,因此初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。采用单因素试验设计对XZ-1的生物学特性进行研究,结果表明:XZ-1在pH值为6时生长最佳,在氯化钠浓度为0¹0g/L之间时生长情况相对较好;对光暗不敏感,致死温度为100℃、10 min。     

一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

从土壤中分离筛选到一株具有广谱抗菌活性的拮抗细菌,命名为XZ-1。采用平板对峙培养法测定其抑菌活性,结果显示:XZ-1对大蒜叶枯病菌、草莓炭疽病菌等8种重要农作物病害的病原真菌均具有较强的拮抗活性,且抑菌带直径均大于10 mm。采用PCR扩增16S r DNA片段并用MEGA 6.0软件构建系统发育进化树,结果表明XZ-1与解淀粉芽孢杆菌16S r DNA序列KY828923聚为一簇,因此初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。采用单因素试验设计对XZ-1的生物学特性进行研究,结果表明:XZ-1在pH值为6时生长最佳,在氯化钠浓度为0~10g/L之间时生长情况相对较好;对光暗不敏感,致死温度为100℃、10 min。     

野生大孔多孔菌的分离鉴定及生物学特性

为充分开发利用大孔多孔菌资源,通过对左家保护区的野生大孔多孔菌进行传统形态学与分子生物学鉴定相结合的方法,并对其菌丝体的生物学特性从pH值、单色光(昼夜交替)、氮源、无机盐、碳源、温度等影响因素进行了单因素试验和正交试验。系统研究结果表明:该种与大孔多孔菌相似度100%;菌丝体最适培养条件在蓝光(昼夜交替)、30℃下培养,最适无机盐为硫酸镁、最适氮源为牛肉膏、最适碳源为淀粉、pH为5.0。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程...     

灵武长枣干腐病病原菌的分离鉴定及生物学特性研究

为明确灵武长枣干腐病病原菌的种类及其生物学特性,通过对灵武长枣干腐病发病枝条采样,采用组织分离法进行病原菌分离,柯赫氏法则验证和形态学、分子生物学鉴定。结果表明：分离获得3株疑似病原菌,经柯赫氏法则验证确定GF1菌株为灵武长枣干腐病病原菌。依据形态学和分子生物学鉴定,确定GF1菌株为木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)。GF1菌株菌丝生长的最适温度为25～30℃,最适pH为6;孢子萌发的最适温度为28℃,最适pH为7;光照条件有利于孢子萌发;孢子致死条件为55℃/20 min和60℃/10 min及以上处理。