芸薹属植物非编码RNA BcMF11基因同源序列的克隆及进化分析

芸薹属植物资源丰富,具有重要的经济价值,但其亲缘进化关系较复杂.非编码RNA是一类在生物体内广泛存在的,没有明确的开放阅读框,但能够在生活活动中行使多种调节功能的特殊基因(Storz,2002).     

耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans中非编码RNA

耐辐射奇球菌(Deinococcus Radiodurans)对电离辐射、紫外线以及强氧化剂等方面具有惊人的抗性。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在参与转录调控、RNA的加工与修饰、mRNA的转录、蛋白质的运输与稳定性调节等方面具有非常明显的作用。本文通过概率上下文无关算法(Stochastic ContextFree Grammar,SCFG),对耐辐射奇球菌R1菌株的基因间序列进行相似二级结构预测,结果发现,在耐辐射奇球菌R1基因组的非编码区存在28个非编码RNA家族。其中IRE家族成员最多,其次是Histone3、tRNA和SECIS家族。所发现的DicF与ctRNA_pGA1t、mRNA等家族成员为细菌所特有。与其他生物比较分析结果显示,可以用这些非编码RNA来研究耐辐射奇球菌的生物学功能,并为进一步研究其DNA损伤与修复分子机制提供依据。     

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilis）为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。     

巴西橡胶树HbMCS1基因的克隆及表达分析

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶（2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS）是异戊烯基焦磷酸合成途径之一——甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate,MEP）途径中的第五个酶,催化2-磷酸-4- (胞苷-5’-二磷酸)- 2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸。根据植物MCS的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的MCS基因,命名为HbMCS1。序列分析表明HbMCS1长965bp,编码241个氨基酸,该氨基酸序列与长春花、拟南芥、水稻、银杏和三尖杉的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%。半定量RT-PCR结果显示,伤害诱导胶乳HbMCS1的表达,乙烯对HbMCS1的表达几乎没有影响;HbMCS1的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达。HbMCS1的克隆和表达分析为了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和对天然橡胶生物合成的调控作用打下了基础。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因As-1-SST的克隆与表达分析

植物果聚糖是一类重要的可溶性碳水化合物,其在植物中的积累可提高植物的抗逆性。为了解大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的序列特征和功能,本研究采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)得到乐都紫皮大蒜As-1-SST基因全长序列,利用BLAST、DNAMAN、ProtParam、SWISS-MODEL、MEGA等生物信息工具分析其序列特征,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析As-1-SST基因在大蒜根、假茎、叶片和鳞芽中的表达差异及其对低温和干旱胁迫的响应情况。结果表明,大蒜As-1-SST基因全长1 872 bp, 编码623个氨基酸,推测蛋白质分子质量为69.76 kDa,理论等电点为5.19,为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,As-1-SST蛋白主要定位于液泡,该蛋白无信号肽,包含2个特异位点,属于糖苷水解酶32(GH32)家族。在进化关系上,大蒜As-1-SST与百合科的洋葱1-SST亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,As-1-SST基因在根中的表达量最高,其次是假茎,在鳞芽和叶片中表达水平较低,具有明显的组织特异性;不同组织As-1-SST对于低温及干旱胁迫的响应差异显著,低温胁迫显著诱导了根、假茎、叶片中As-1-SST的表达,而干旱胁迫只显著提高了鳞芽中As-1-SST的表达量,说明大蒜各组织As-1-SST对逆境信号的响应机制不同。本研究为进一步鉴定大蒜果聚糖合成酶基因的生物信息学功能和表达调控机制提供了一定的理论依据。     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

印度南瓜Na+/H+逆向转运蛋白基因CmaSOS1的克隆与表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(SOS1)是植物耐盐的关键因子之一,在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为解析印度南瓜SOS1基因的序列特征和功能,利用生物信息学和分子生物学方法对其进行研究。结果表明,克隆获得印度南瓜SOS1基因cDNA全长序列,命名为CmaSOS1,GenBank登录号:NW_019272028。序列分析表明,CmaSOS1基因的cDNA全长3 940 bp,包含一个3 429 bp的开放阅读框架,编码1 142个氨基酸。CmaSOS1基因含有23个外显子和22个内含子,全长46 314 bp。CmaSOS1蛋白的分子量为126.7 kDa,理论等电点为5.92,包含12个跨膜结构区域,具有一个Na_H_Exchanger superfamily结构域和一个CAP_ED superfamily结构域;CmaSOS1蛋白属于疏水性稳定蛋白,二级结构元件多为无规卷曲和α-螺旋。CmaSOS1蛋白与葫芦科的中国南瓜、西葫芦、甜瓜、黄瓜和苦瓜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的同源性较高,序列一致性分别为98%、98%、90%、89%和89%。实时荧光定量PCR分析表明,CmaSOS1基因在印度南瓜的根和叶中表达量较高,在茎、花、果实中的表达量较低;该基因受NaCl和聚乙二醇(PEG)诱导后均呈上调表达,推测CmaSOS1基因可能在印度南瓜抵御盐分胁迫和干旱胁迫过程中发挥重要作用。本研究为进一步揭示CmSOS1在非生物胁迫下的功能奠定了基础。     

甘蓝SRK激酶结构域编码区分子特性及其与THL1相互作用检测

以甘蓝‘E1’为材料，采用PCR和RT-PCR技术，扩增SRK激酶结构域（记为SRKE1）编码区DNA和cDNA序列，得到片段长度分别为1711bp和1241bp，序列分析表明该序列由五个内含子和六个外显子组成，编码407个氨基酸；构建了SRKE1原核表达质粒pET43.1-SRKE1和真核表达质粒pPIC9K-SRKE1，分别在表达宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。用我们表达的THL1与SRKE1孵育，结果显示SRKE1可与THL1结合并形成稳定的复合体。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

青花菜BoCHS2基因的克隆、表达和反义载体的构建

根据前期的研究结果设计PCR引物,从青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片基因组DNA和cDNA中克隆到了查尔酮合成酶基因,定名为BoCHS2.BoCHS2的基因组DNA全长为1267bp,具一个长度为85bp的内含子,基因编码区全长为1182bp,编码393个氨基酸.基因序列已提交至...     

紫菜薹快速碱化因子基因BcMF14p的序列与表达分析

快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子。根据已知的普通白菜两用系中可育株系特异表达的快速碱化因子基因BcMF14序列,在其编码框两侧设计引物,从紫菜薹中克隆出该类信号分子基因,命名为BcMF14p(登陆号:EF523517),全长273 bp,不含内含子,编码框包含222个核苷酸,编码73个氨基酸。NCBI在线同源比对结果表明该基因属于快速碱化因子家族,与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子核苷酸序列相似性达到86%以上。对该信号分子的表达进行RT-PCR分析,结果显示BcMF14p只在紫菜薹花蕾、花、角果等生殖器管中表达,在茎、叶等营养器官中不表达,说明BcMF14p可能参与紫菜薹生殖发育过程中的信号传导。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。     

盐地碱蓬SsDREB基因的克隆与表达分析研究

盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）是典型的盐碱地指示性植物。本研究以盐地碱蓬为材料,根据其他植物中干旱应答元件结合蛋白保守区的氨基酸序列设计简并引物,通过PCR扩增到一条长180bp的cDNA片段,继而利用RACE技术克隆了一个盐地碱蓬DREB基因全长cDNA,命名为SsDREB。SsDREBcDNA全长为14...     

粤油7号花生AhNCED1基因启动子克隆及其活性分析

AhNCED1是干旱胁迫下花生中调控脱落酸（abscisic acid,ABA）生物合成的关键基因。本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗旱性强的粤油7号花生中克隆AhNCED1基因起始密码子ATG上游2392bp启动子序列,构建该启动子驱动报告基因GUS的植物双元表达载体pAhNCED1p∷GUS,转化野生型拟...     

平榛ChWRKY1转录因子的克隆及表达模式分析

根据平榛花芽转录本高通量测序的结果,采用RACE-PCR法克隆到1个平榛WRKY基因,全长1273bp,推断其编码317个氨基酸,命名为ChWRKY1。序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第2类成员,只含有1个WRKY结构域,锌指结构为C-X5-C-X23-H-X1-H,构建的系统发育树结果表明,它与杨树PtWRKY5、葡萄VvWRKY4的亲缘关系较近,相似性分别为69%和64%。采用qRT-PCR,以Actin为内参对ChWRKY1基因在自然条件下花芽部位的表达模式进行分析,结果显示在自然条件下12月份达到最高的表达量,随后表达量呈现下降的趋势;对平榛根蘖苗进行4℃低温胁迫处理,叶片中ChWRKY1基因快速上调表达,4h达到最大表达量,表明该基因可能参与平榛对低温胁迫的早期应答反应;冬季(1月份)ChWRKY1基因在韧皮部中的表达高于花芽和雄花序,具有组织表达特异性。     

小麦RPL21基因同源克隆与表达分析

为了解60S核糖体蛋白L21(ribosomal protein L21,RPL21)的基因组结构和表达模式,以GenBank数据库中小麦RPL21基因的部分序列为信息探针,采用RT-PCR和PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆了RPL21基因的cDNA与DNA片段,并对该基因在小麦多子房近等基因系间的表达差异和多子房...     

香石竹ACC氧化酶基因克隆及其反义表达载体构建

据已报道的香石竹氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因的cDNA序列设计特异引物,以香石竹品种“Master”基因组DNA为模板,用PCR方法克隆出香石竹ACO基因的部分序列。测序结果显示,克隆的序列与已报道序列基本一致。将克隆的香石竹ACO片段反向连接到植物表达载体pCAMBIA 1301中CaMV 35S启动子的下游,构建了香石竹ACO基因的反义表达载体pCAM-ACO2,为进一步通过反义技术延长转基因香石竹的花期奠定了基础。     

牡丹PsMADS5基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉（Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen）为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5＇非编码区、302bp的3＇非编码区...     

二化螟鞘磷脂合酶相关基因CsSMSr的克隆、真核表达及表达谱分析

鞘磷脂合酶(SMS)基因家族在鞘脂质代谢中起着关键作用,可以通过调节神经酰胺和甘油二酯的平衡调控细胞的生存和凋亡.本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆得到1个二化螟鞘磷脂合酶相关基因的全长eDNA,命名为CsSMSr(Genbank登录号:JQ664739).CsSMSr开放阅读框1587bp,可编码528个氨基酸;序列分析表明,CsSMSr基因编码的蛋白N端具有保守的SAM结构域,含6个跨膜区域,并且有4个SMS家族特有的保守区域D1～D4,保守区D3和D4上有活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):His302,His345,Asp349.CsSMSr在粉纹夜蛾Tn细胞内成功表达,Western blot检测表达产物分子量约60kDa.应用实时荧光定量PCR方法分析该基因在二化螟不同发育阶段和不同组织的表达,结果表明,CsSMSr随着二化螟的生长发育表达水平逐渐升高,在成虫时期达到最大;CsSMSr的表达具有组织特异性,二化螟雌成虫和雄幼虫生殖器官中的CsSMSr表达量都显著高于其他器官,在二化螟雄成虫精巢中表达量也较高,但与中肠和马氏管差异不大.CsSMSr的表达有时间特异性和组织特异性,推测该基因在二化螟的发育和生殖中有重要作用.本研究成功克隆并表达了二化螟鞘磷脂合酶相关基因,为进一步对该基因进行功能鉴定奠定了基础.