人促红细胞生成素基因和AcGFP1共表达真核表达载体的构建

人促红细胞生成素(human erythropoietin,hEPO)是一种由肾脏分泌的酸性糖蛋白激素。它是一种红细胞造血刺激因子,在医学临床,主要用于治疗肾性贫血,对其它各种疾病和     

牛MEN1基因真核表达载体的构建及其表达分析

多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P＜0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系.     

稳定表达Wnt3a基因的猪胰腺干细胞株的建立

Wnt3a是经典Wnt通路上游的一个重要分泌蛋白,Wnt3a蛋白的活化可促进多种细胞的增殖和分裂。为了揭示Wnt3a在猪胰腺干细胞(PSC)增殖及分化中的调控机理,采用RT-PCR从pGKS2P(+)-Wnt3a质粒中扩增出Wnt3a全长片段,将测序正确的Wnt3a连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP1)报告基因的真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,构建重组质粒。经EcoRⅠ/BamHⅠ酶切鉴定后,用脂质体转染至猪PSC。用抗生素G418筛选3周后获得稳转pIRES2-AcGFP1-Wnt3a的细胞株。荧光显微镜下观察到几乎所有细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR和Western blot的结果显示,稳转Wnt3a组的猪PSC中Wnt3a mRNA及蛋白表达水平比对照组明显升高。这些结果表明,稳定表达Wnt3a的猪胰腺干细胞株成功建立,为进一步研究Wnt3a在猪PSC增殖及分化中的作用机理提供了基础资料。     

人IGF-1基因重组杆状病毒表达载体的构建及在sf9细胞中的表达

以pcDNA3．1／IGF-1为模板，采用PCR方法对IGF-1基因进行扩增，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切回收含IGF-1基因的DNA片段，与pFastHTA连接，获得重组载体pFast／IGF-1；将其转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH10Bac感受态细胞，经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-IGF-1，PCR鉴定得到单-／GF-1条带。将该病毒载体转染sf9细胞，进行病毒重组，Western-blot检测／GF-1表达，并用MTT法检测促内皮细胞生长活性。结果成功获得了重组病毒，Western-blot检测出现1条约13．0kD的带，MTT法检测IGF-1促细胞生长率为24．4％。     

苹果sMdCAX1基因超表达载体的构建及遗传转化

为使sMdCAX1基因能在苹果中高效表达,改善苹果对Ca~(2+)吸收转运的能力,本研究构建了sMdCAX1植物超表达载体并将其通过农杆菌介导法转入长富6号苹果中。根据MdCAX1基因序列设计引物,从长富6号中克隆MdCAX1基因,通过PCR方法截除编码MdCAX1基因的N末端序列,获得sMdCAX1片段。利用重叠PCR方法将sMdCAX1序列中的SacI位点进行定点突变,并在序列两端分别添加BamHI和SacI酶切位点,获得长度为1272bp的突变序列sMd1+2Mu。利用BamHI和SacI双酶切sMd1+2Mu和植物表达载体pYH4215,目的片段经回收、连接、转化和筛选,获得植物双元表达载体pYH4215-sMd1,并将该载体转化农杆菌菌株EHA105。以长富6号无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化获得了转基因植株,经鉴定,有6个株系呈GUS染色阳性,其中2个株系呈PCR阳性。进一步对PCR鉴定阳性的株系进行RT-PCR分析,表明sMdCAX1基因在这2个株系中得到表达。本试验结果为进一步研究苹果MdCAX1基因的功能和通过转基因方法提高苹果果实钙含量奠定了基础。     

四环素诱导型单载体的构建、体外表达与鉴定

pTet-on-Advanced双载体表达系统应用于转基因动物研制,需要建立两种动物品系,经过杂交和筛选,才有可能得到转基因个体,操作繁琐,转化效率低。本研究在改良的四环素(Tet-on)基因可调控系统基础上,通过PCR的方法,分别从pTet-on-Advanced质粒和pEGFP-N1质粒中扩增rtTA和EGFP基因,测序正确后,将rtTA和EGFP基因亚克隆入pTRE-Tight载体中,构建四环素pTRE-Tight-rtTA-EGFP单载体表达系统,然后采用脂质体法,将新构建的单载体表达体系pTRE-Tight-rtTA-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞,以不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1和1g/L)强力霉素(Dox)诱导,通过荧光显微镜检测EGFP的表达量。结果显示,转染48h后,未加Dox无绿色荧光表达;1g/LDos诱导可以观察到绿色荧光;Dox浓度分别为0.0001、0.001、0.01和0.1g/L未观察到绿色荧光。表明1g/LDox才能激发调控作用。本研究成功构建pTRE-Tight-rtTA-EGFP新型可控性真核表达载体,该载体在细胞中的表达受Dox的调控,能正常发挥作用。研究结果为转基因的定量表达提供了新的技术平台,也为将构建的单载体用于表达可控的转基因动物研究提供了重要科学依据。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的构建及其稳定表达细胞株的建立

利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。     

牛p53基因真核表达载体构建及其在卵母细胞中表达定位

p53是一种肿瘤抑制基因,在细胞周期阻滞、细胞凋亡、衰老和自噬过程中发挥着调控作用,在机体的各个组织中广泛表达.本研究旨在构建牛p53基因真核表达载体并研究其在牛卵母细胞中的表达和定位.首先从牛(Bos taurus)卵丘细胞中克隆了p53基因并将其连接到pMD 19-T载体上,双酶切鉴定后定向连接到pVenus载体上构建了pVenus-p53真核表达载体,经脂质体2000介导转染Hela细胞,确定重组质粒在Hela细胞中的表达定位,主要定位于细胞核.然后用体外转录试剂盒将p53-Venus转录成cRNA,通过显微注射观察其在卵母细胞中的表达定位情况,主要定位于细胞核,但胞质中也有少量表达.最后,取体外培养不同时期的牛卵母细胞,通过实时定量PCR检测p53在体外培养不同时期的表达量的变化,采用2-ΔΔC法分析p53/β-actin表达水平的变化值,p53的表达从GV期到MⅠ期迅速升高,在MⅠ期其表达量达到最高,随后又逐渐降低.本研究构建了牛p53真核表达载体pVenus-P53,并且体外转录的p53-Venus cRNA能在牛卵母细胞中正确表达定位,检测了p53在牛卵母细胞成熟培养各个时期表达量的变化,为进一步研究p53在牛卵母细胞体外成熟中的作用提供了参考资料.     

猪resistin(Retn)基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。     

真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达

为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到船PC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子（1123bp）、α球蛋白B基因启动子（1149bp）连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。     

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.     

利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达

本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73％、52％和85％;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台.     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。