青钱柳ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的SDS法提取青钱柳基因组DNA,测试青钱柳ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA、Mg2+、dNTP、BSA、引物\Taq酶6个因素对青钱柳ISSR扩增的影响。结果表明:合适的退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μlPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液浓度为(10 mmol/LTris.HCl,pH值9.0,浓度为50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),12 ng模板DNA,浓度为1.5 mmol/LMgCl2,浓度为1.0 mmol/L4×dNTP,1mg/ml BSA,15 pmol引物,0.75 UTaq酶。     

水稻土总微生物RAPD扩增条件的优化

以改进的CTAB-溶菌酶-蛋白酶K裂解法抽提水稻土总微生物DNA,直接进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析。采用单因素试验分别测试了Mg2 浓度、4×dNTP浓度、模板DNA用量、引物用量、TaqDNA聚合酶用量及牛血清白蛋白(BSA)浓度对水稻土总微生物RAPD扩增的影响,确定了最适的RAPD反应体系为:10μlPCR反应体积,含1×Taq酶缓冲液(10 mmol Tris-HC l pH值9.0,50 mmol KC l,0.1%Triton X-100),0.8mmol/L 4×dNTP,5.0 mmol/L MgC l2,0.75 UTaqDNA聚合酶,3 mg/m l BSA,5 ng模板DNA,5 pmol引物。     

牛膝ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的SDS法提取牛膝(Achyranthes bidentata)基因组DNA,利用单因素试验对ISSR反应体系中的Mg2+浓度、dNTP浓度、模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、BSA浓度、引物用量进行筛选和优化,得出了适用于牛膝ISSR分析的扩增条件:10 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(200 mmol/L Tris·HC1,pH值8.8,100 mmol/LKCl,1％ TritonX - 100,100 mmol/L( NH4) 2SO4,15 mmol/L MgCl2),1.5 UTaq DNA聚合酶,2 mg/mL BSA,15 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 mmol/L dNTP,2.0 mmol/L Mg2.利用优化反应体系从100个ISSR引物中筛选出12个重复性好、稳定性高的引物对24个牛膝个体的DNA进行扩增,共得到85个位点,其中74个为多态位点,多态位点百分率为87.06％,Nei指数为0.330 3,Shannon信息指数为0.490 5,表明牛膝的遗传多样性处于较高水平.     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

甜槠ISSR-PCR反应体系的正交优化

对甜槠Castanopsis eyrei进行遗传多样性研究的过程中,为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR扩增结果,利用正交设计对Mg2 ,dNTP,引物,Taq酶,牛血清蛋白(BSA)和模板DNA等6种因素5个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR最适宜反应体系为:10μL反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH 9.0,50 mmol.L-1KCl,10 g.L-1TritonX-100),1.7 mmol.L-1Mg2 ,0.25 mmol.L-1dNTP,8.34 nkatTaqDNA聚合酶,1.5 g.L-1牛血清白蛋白,6 pmol引物,12 ng模板DNA。甜槠扩增时引物UBC846的最适退火温度为56.3℃。图2表1参23     

接骨草ISSR扩增条件优化

采用改进的SDS法提取接骨草叶片中的基因组DNA,通过单因素试验对接骨草ISSR反应体系中的模板DNA用量、引物用量、dNTP用量、牛血清白蛋白浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度等进行筛选和优化,得到适合接骨草ISSR扩增的条件,10 μL PCR反应体系:1×Taq酶配套缓冲液,4ng模板DNA,1.5μmol/L引物,0.2mmol/L dNTP,2 mg/mL BSA,0.75 U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L Mg2+.利用优化后的反应体系从100个ISSR引物中筛选出12个重复性好、稳定性高的引物对24个接骨草个体的DNA进行扩增,共得到111个位点,其中103个为多态位点,多态位点百分率为92.79％,Nei指数为0.402 6,Shannon信息指数为0.5790,表明接骨草的遗传多样性水平很高.     

大血藤ISSR-PCR反应体系的建立

采用改进的SDS法抽提大血藤基因组DNA,分析了镁离子、dNTP、模板DNA含量、引物浓度、Taq DNA聚合酶量和BSA浓度对大血藤ISSR-PCR扩增结果的影响,建立了稳定的、可重复的大血藤ISSR最佳反应体系:10μL PCR反应体积中,4×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HC l,pH9.0,50 mmol/L KC l,1 g/LTriton X-100),0.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgC l2,0.1 mmol/L dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg/mL牛血清白蛋白。大血藤的最适退火温度为52.4℃。     

隐性核不育芝麻AFLP反应体系的优化

以芝麻细胞核雄性不育系95ms-5为材料,对AFLP反应体系中的酶切连接、预扩增和选择性扩增中的关键性因素进行了优化。结果表明,在模板DNA质量浓度为200ng/μL、37℃酶切连接6h的情况下,预扩增中最佳Mg2+浓度为1.0mmol/L,dNTP最佳浓度为0.3mmol/L,Taq酶量以0.5U为宜,预扩增引物终浓度为0.4mmol/L;选择性扩增中,预扩增产物稀释10倍后,以Mg2+0.8mmol/L、dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、选扩引物0.6mmol/L为宜。     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

北方粳稻SRAP反应体系的建立与优化

以粳型旱稻品种焦旱1号总DNA为材料,首先对影响北方粳稻SRAP-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素进行了初步优化,分析了各因素对SRAP-PCR扩增结果的影响。在此基础上对影响SRAP-PCR反应的Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等4个主要因素进行了正交优化。研究结果表明,利用引物组合Me6/em7对18个北方粳稻品种进行了成功扩增,最佳条件为:25μL SRAP-PCR反应体系中,模板DNA为20 ng;Mg2+为2.0 mmol/L;dNTP为0.3 mmol/L;正反引物为15 pmol;TaqDNA聚合酶为1.5 U。