不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用

小麦6VS·6DL易位系Pm97033和6VS·6AL易位系92R137中的6VS染色体臂来自不同的簇毛麦种质,均表现良好的白粉病抗性,本研究利用分子标记对这2个易位系所包含抗病基因的异同进行了鉴定。利用与Pm21抗白粉病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Stpk-V基因(GenBank登录号为HQ864471.1)的基因组和cDNA序列为基础,在包含至少1个内含子的2个编码区设计引物,从Pm97033中扩增获得特异的多态性片段。为进一步提高特异性和扩增的稳定性,对特异扩增片段测序并重新设计引物,扩增筛选获得2个引物对,其中PK-F1/PK-R可专一扩增6VS·6DL易位系Pm97033及其抗病亲本,而PK-F2/PK-R可同时特异扩增2个不同来源的簇毛麦6VS染色体,但二者间的特异片段具有多态性。利用这2对引物,对系谱中包含6V(6D)和6VS·6AL、抗白粉病的小麦品系CB037进行检测,发现仅出现与6VS·6AL易位系相同的簇毛麦扩增片段,不存在簇毛麦No. 1026 (Pm97033的6VS供体)的扩增片段。基因组原位杂交结果表明,CB037仅含1对小麦-簇毛麦的易位染色体,用已报道的分子标记检测证明易位涉及的小麦染色体为6A,与本研究开发的分子标记检测结果相吻合,表明CB037携带的白粉病抗性基因来自6VS·6AL易位系92R137,其白粉病抗性可能与Pm97033具有不同的遗传基础。     

簇毛麦6VS上4个新分子标记的鉴定及与抗白粉病基因Pm21的连锁分析

Pm21具有强抗白粉病特性，位于簇毛麦6V染色体短臂（6VS）上。染色体分析和白粉病抗性检测表明，Pm21在受体小麦内是稳定遗传的。筛选与Pm21相连锁分子标记，在小麦抗白粉病辅助选择育种上有重要意义。利用RAPD和AFLP分子标记方法，对簇毛麦6V染色体和含有6V的小麦-簇毛麦代换系、6VS的易位系6AL/6VS、6DL/6VS进行分子标记筛选，以分析位于6VS上的分子标记及其与Pm21的关系。RAPD检测表明，OPK08910特异片段存在于含簇毛麦6V染色体的代换系（6A/6V）、易位系（6AL/6VS，6DL/6VS）和簇毛麦中。AFLP检测显示，PstⅠ+AGG / MseⅠ+CAC、PstⅠ+ACC / MseⅠ+CCT和PstⅠ+ AAG / MseⅠ+CGC 共3对引物分别可以在6A/6V、6AL/6VS、6DL/6VS和VV中扩增出264 bp、218 bp和232 bp特异带，并与抗白粉病基因Pm21共分离，因此，上述来源于6VS上的4个新的分子标记，可作为源自簇毛麦Pm21基因的选择标记，用于小麦抗病育种。     

簇毛麦6V染色体短臂特异分子标记的开发和应用

为开发簇毛麦6V染色体短臂特异的分子标记,并利用这些标记对缺失系进行鉴定,选用11个RGA和17对STS引物进行多态性分析,其中1个RGA引物和1对STS引物在对普通小麦扬麦5号、簇毛麦及普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系进行多态性分析时,分别检测到一条约1 000 bp和约800 bp的多态性片段,将这两个标记转化为稳定的特异性分子标记,分别命名为CINAU17-1086和CINAU18-₇₂₃。运用这两对引物对一系列材料进行扩增,只有含6V染色体短臂的材料才能扩增出相应的特异条带,表明这两个标记均位于簇毛麦6VS上。进一步利用簇毛麦6VS缺失添加系、易位系将CINAU17-₁₀₈₆标记定位在簇毛麦6VS FL0.58与FL0.70之间,将CINAU18-₇₂₃标记定位在簇毛麦6VS FL0.45与着丝粒之间。利用这两个特异标记对通过花粉辐射获得的部分簇毛麦6VS结构变异材料进行PCR鉴定,其结果与细胞学鉴定结果一致。CINAU17-₁₀₈₆和CINAU18-₇₂₃标记可用来快速检测和追踪导入普通小麦背景中的簇毛麦6VS染色体片段,并对缺失系的断点进行了初步界定。     

簇毛麦6VS特异转录序列P21461及P33259的获得及其分子标记在鉴定小麦-簇毛麦抗白粉病育种材料中的应用

簇毛麦6V#2S和6V#4S染色体臂分别携带抗白粉病基因Pm21和Pm V,在与小麦的杂种后代中,抗病基因与外源染色体臂共分离。开发鉴定2条外源染色体臂间多态性的序列,尤其是遗传信息相对缺乏的6V#4S染色体臂的序列,对于其在遗传与育种上的应用具有重要意义。本研究以携带6V#4S·6DL染色体的小麦易位系Pm97033及感病小麦亲本宛7107接种白粉菌的叶片转录组数据为资源,通过差异基因筛选、共线性分析、簇毛麦基因组扩增及测序验证的方法,鉴定出来自6V#4S的表达序列P21461和P33259,其中基于P21461序列设计的引物P461-5在簇毛麦6V#2S和6V#4S染色体臂的扩增产物具有30 bp的In Del和4 nt的多态性。用该引物转化的标记P461-5a可以鉴定抗白粉病小麦品种和高代品系所含的外源染色体,显示其在簇毛麦抗源鉴别和小麦抗病育种辅助选择中潜在的应用价值。根据P33259开发的标记P259-1可以对含有6V#4S染色体臂的材料进行特异扩增,但对6V#2S·6AL易位染色体没有扩增产物,因此P259-1可作为6V#4S·6DL易位染色体的特异分子标记。q RT-PCR分析结果显示,P21461的表达不受白粉菌诱导,而P33259在接菌后12 h和24 h的转录水平比接菌前提高约2倍,推测其可能参与Pm97033与白粉菌的早期互作。     

一个花粉辐射诱导的小麦-簇毛麦相互易位染色体系的分子细胞遗传学研究

利用⁶⁰Co-γ-射线处理小麦-簇毛麦6V单体添加系花粉，并给中国春授粉，在一个M1单株减数分裂中期Ⅰ检测到一个由2条小麦-簇毛麦易位染色体和一条完整小麦染色体构成的三价体，说明参与易位的2个小麦片段均来自同一条小麦染色体，推测两条易位染色体由相互易位产生。将其中涉及外源大片段的易位染色体称为外源大片段易位（large alien segment translocation, LAST），涉及外源小片段的称为外源小片段易位(small alien segment translocation, SAST)。对后代中两个易位染色体均纯合的植株（LAST’’+SAST’’, 2n = 44）进行顺次C-分带和GISH研究，结果表明外源大片段易位染色体为T7BS-6VS•6VL，外源小片段易位染色体为T6VS-7BS•7BL，易位断点分别位于7B染色体短臂约FL0.60处及6V染色体短臂约FL0.70处。在M2代群体中检测到7种染色体组成类型，比例为3(LAST’’+SAST’’)∶20(LAST’+SAST’)∶2(LAST’’+SAST’)∶1(LAST’+SAST’’)∶1LAST’∶2SAST’∶22(0型)，其中外源大片段和外源小片段易位染色体往往相伴出现。抗病鉴定结果显示抗白粉病基因位于外源大片段易位染色体T7BS-6VS•6VL上。对LAST’+SAST’型（2n = 43）M₂代单株花粉母细胞减数分裂的GISH研究结果显示，88.5%的后期Ｉ或末期Ｉ细胞中出现T6VS-7BS•7BL和T7BS-6VS•6VL的共分离。此外，在个别后期Ｉ细胞中观察到外源大片段易位染色体T7BS-6VS•6VL发生落后和着丝粒断裂现象，并在LAST’型单株（2n =42）的自交后代中筛选到一个通过着丝粒断裂-融合产生的外源小片段插入易位T7BL•6VS-7BS，这为利用外源大片段易位进一步创制携带抗病基因的小片段插入易位提供了新的思路。还分别获得了T7BS-6VS•6VL和T6VS-7BS•7BL的纯合易位系。     

基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用

为定位、转移和利用簇毛麦有益基因, 通过花粉辐射, 获得一批包括小麦-簇毛麦易位染色体的异染色体系。为了鉴定这批材料中的簇毛麦染色体身份, 根据水稻、小麦的EST序列合成了240对STS引物, 其中34对引物在普通小麦中国春与簇毛麦间存在多态性;进一步对亲本及簇毛麦二体异附加系进行PCR扩增分析, 标记CINAU32_-300可追踪簇毛麦1V染色体, 标记CINAU33_-280、CINAU34_-510、CINAU35_-1100、CINAU36_-380和CINAU37_-400可追踪簇毛麦2V染色体, 标记CINAU38_-250可追踪簇毛麦3V染色体, 标记CINAU39_-950和CINAU40_-800可追踪簇毛麦4V染色体, 标记CINAU41_-745和CINAU42_-1050可追踪簇毛麦5V染色体, 标记CINAU44_-765和CINAU45_-495可追踪簇毛麦7V染色体。加上本室已开发的2个6V染色体特异标记, 用这些簇毛麦特异分子标记鉴定辐射诱导材料的部分回交后代, 选育出小麦背景中只包含单条簇毛麦染色体的整套1V至7V染色体系, 同时有18条易位染色体的簇毛麦身份得到确定, 表明这些标记可以用来快速检测普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。     

A sequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosomes 6AS, 6BS, 6DS of Triticum aestivum and 6VS of Haynaldia villosa

To develop markers linked with Pm21 located on chromosome 6VS of Haynaldia villosa, a pair of primers (NAU/xibao15F and NAU/xibao15R) were designed according to the sequence of a serine/threonine kinase gene (Contig17515), whose expression was induced by Blumeria graminis and selected from the gene expression experiment using the Barley GeneChip. Using genomic DNA of various genetic stocks including the wheat variety ‘Yangmai#5’, H. villosa, Triticum durum–H. villosa amphiploid, seven T. aestivum–H. villosa addition lines involving chromosomes 1V–7V, the translocation line T6VS·6AL, and 21 nullisomic–tetrasomic and eight deletion lines of T. aestivum‘Chinese Spring’ as templates, four amplicons specific for 6VS, 6AS, 6BS and 6DS, respectively, were produced. F₂ individuals derived from the cross of ‘Yangmai#5’ × T6VS·6AL were analysed, and data indicate that NAU/xibao15₉₀₂ could be used as a co‐dominant marker for selecting Pm21 located on 6VS.     

普通小麦-簇毛麦易位系T4VS·4VL-4AL的选育与鉴定

利用染色体C-分带和基因组原位杂交分析,从普通小麦-簇毛麦4V染色体二体异附加系（DA4V）与普通小麦农林26-离果山羊草3C染色体二体异附加系（DA3C）杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易位系T4VS·4VL-4AL。SSR和RFLP标记分析表明,该易位染色体包括4VS、4VL近着丝粒部分区段和4AL顶端区段;该易位系具有良好的细胞学稳定性,结实正常,为杀配子染色体诱发形成的补偿型易位;易位系T4VS·4VL-4AL高抗梭条花叶病,是小麦抗病育种新种质。     

普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk#1染色体特异分子标记的筛选

为筛选普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk^#1染色体特异分子标记，根据已定位于普通小麦第一部分同源群的EST序列设计104对STS引物，对中国春、鹅观草、黑麦及簇毛麦进行多态性分析。在104对STS引物中，有53对在对照普通小麦中国春与鹅观草、黑麦及簇毛麦之间存在多态性。利用普通小麦-黑麦1R~7R二体异附加系筛选出5对黑麦1R染色体特异标记，分别是CINAU 19-₅₀₀、CINAU20-₉₅₀、CINAU21-₁₅₀₀、CINAU22-₃₁₀和CINAU23-₂₀₀₀；利用普通小麦-簇毛麦1V~7V二体异附加系筛选出5对簇毛麦1V染色体特异标记，分别是CINAU23-₁₇₀₀、CINAU24-₁₀₅₀、CINAU25-₁₆₅₀、CINAU26-₅₀₀和CINAU27-₆₂₀；利用鹅观草二体异附加系DA1Rk^#1、异代换系DS1Rk^#1(1A)、端体系DA1Rk^#1L、易位系T1Rk^#1S·W、长臂缺失系Del1Rk#1L筛选出5对鹅观草1Rk^#1特异标记，分别是CINAU27-₉₆₀、CINAU28-₁₃₆₀、CINAU29-₄₈₀、CINAU30-₅₆₀和CINAU31-₅₂₀。研究表明，可以利用普通小麦的EST序列设计PCR引物，转化成STS标记，筛选普通小麦近缘物种黑麦、簇毛麦及鹅观草等染色体特异的分子标记，快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1Rk^#1染色体或染色体片段，为深入研究普通小麦远缘杂种材料提供新的工具。     

簇毛麦1V染色体SSR标记的筛选

选用位于普通小麦1A、1B、1D染色体上的32对微卫星引物对普通小麦中国春、簇毛麦、6个中国春-簇毛麦二体附加系和1个普通小麦-簇毛麦二体代换系进行SSR分析,发现引物Xgwm498在簇毛麦中扩增出2条长分别为110 bp和190 bp的片段（即Xgwm498/110和Xgwm498/190）, 这两个片段仅在簇毛麦、中国春-簇毛麦1Ha附加系中出现,其余2Ha、     

Chromosome location and microsatellite markers linked to a powdery mildew resistance gene in wheat line 'Lankao 90(6)'

Wheat lines known as 'Lankao 90(6)', derived from the cross 'Mzalenod Beer' (hexaploid triticale)/'Baofeng 7228'//'90 Xuanxi', carry a recessive powdery mildew resistance gene temporarily named PmLK906 . Gene PmLK906 appears to be different from known wheat powdery mildew resistance genes. PmLK906 was tagged using microsatellite markers in a segregating population derived from the cross 'Chinese Spring'/'Lankao 90(6)21-12'. The dominant microsatellite marker Xgwm265-2AL was linked in repulsion with PmLK906 at a genetic distance of 3.72 cM, whereas the co-dominant Xgdm93-2AL was linked to PmLK906 at a genetic distance of 6.15 cM. Both markers were placed on chromosome arm 2AL using 'Chinese Spring' nulli-tetrasomic lines. The recessive PmLK906 has a different specificity to the dominant resistance alleles located at the Pm4 locus and appeared to be located to a locus different from Pm4 .     

小麦-簇毛麦染色体代换系、易位系Ⅴ染色体RAPD标记筛选

利用105条S系列和100条Operon随机引物,对小麦一簇毛麦代换系(6V／6A)、两个易位系(6VS／6AL,6VS／6DL)及亲本簇毛麦(VV)、硬粒小麦(AABB)、栽培小麦(AABBDD)的多态性进行了筛选分析。80．95％的S系列引物扩增出了结果,且条带较清晰;在100条OP系列引物中均扩增出结果,条带清晰可见。从205个随机引物中发现,只有1个引物OPW03在含有簇毛麦V染色体的4个材料中均扩增出l条约570bp的谱带,而在栽培小麦和硬粒小麦中没有发现。因此,可以推测这个分子标记(OPW03—570)是位于簇毛麦V染色体短臂上的。     

簇毛麦1V染色体的传递及品质效应分析

簇毛麦是小麦的一个野生近缘种,小麦-簇毛麦1V异附加系和异代换系的蛋白质含量和沉降值均高,将簇毛麦1V染色体的优质基因导入普通小麦,进一步创造小麦-簇毛麦1V染色体易位系是小麦品质改良的有效途径.以小麦-簇毛麦1V异染色体系材料为基础,用普通小麦连续回交,结合原位杂交和PCR标记鉴定方法,分析1V染色体以及1V结构变异...     

Efficient development of Haynaldia villosa chromosome 6VS‐specific DNA markers using a CISP‐IS strategy

Development of effective molecular markers linked to Pm21 deriving from Haynaldia villosa is critical for wheat breeding of powdery mildew resistance. In this study, we designed 12 pairs of conserved‐intron scanning primers (CISPs), using intron‐containing conserved genes located on the short arm of Brachypodium distachyon chromosome 3 (3BdS) aligned with cDNA or expressed sequence tags (ESTs) of Triticeae crops. Of 12 CISP primer pairs, 11 amplified DNA both in H. villosa and in wheat, and four displayed H. villosa chromosome 6VS‐specific polymorphisms. Six non‐polymorphic DNAs were further sequenced for designing internal primers, and five additional 6VS‐specific markers were obtained. Of the total nine 6VS‐specific co‐dominant markers, six could effectively trace Pm21 in F₂ population derived from the hybrid between the T6AL.6VS line and ‘Yangmai 158’. This study demonstrated that Brachypodium genomic information could be powerfully utilized to develop molecular markers in H. villosa or other Triticeae species.     

小麦背景下冰草6P染色体特异EST标记的开发

小麦-冰草[Agropyron cristatum (L. ) Gaertn.] 6P附加系普冰4844-12具有多粒等可用于小麦改良的优异基因。为高效率检测由小麦-冰草6P附加系衍生的易位系和渐渗系,以普冰4844-12及其亲本普通小麦Fukuhokomugi和冰草Z559 (2n=4x=28, PPPP)为材料,通过对冰草转录组测序获得的EST序列设计的P基因组EST分子标记引物,筛选在普通小麦背景下的6P染色体特异分子标记。结果从1 453对P基因组EST引物中筛选出130对小麦-冰草6P附加系特异标记引物。进而将这些特异标记与NCBI nr蛋白质数据库及小麦EST序列进行了比对,发现4条冰草EST序列的功能注释与抗病、抗逆相关;36条冰草EST与已经定位的小麦EST具有较高的相似性,其中33条(91.67%)位于小麦第6部分同源群染色体。为了进一步验证这些标记的特异性,分别对其中4个具有功能注释的EST标记在中国春等7个普通小麦背景下和随机选择的5个标记在小麦-冰草6P易位系背景下进行了检测,结果证明其确实可用于检测6P染色体。这些冰草6P染色体特异标记的开发为大规模地鉴定小麦-冰草衍生后代中P染色质成分奠定了基础。     

携带抗白粉病基因Pm21的小麦–簇毛麦小片段易位染色体在不同小麦背景中的传递率及遗传稳定性

抗白粉病基因Pm21来自小麦近缘种簇毛麦。小麦一簇毛麦小片段顶端易位系NAU418(T1AS·1AL-6VS)和小片段中间插入易位系NAU419(T4BS·4BL-6VS-4BL)携带Pm21,高抗白粉病,是小麦抗病育种新种质。为了对其育种利用提供依据,以NAU418和NAU419为亲本分别与来源于不同生态区的郑麦9023等12个小麦品种杂交,杂种F_1再分别与来源于不同生态区的农艺亲本进行正、反回交,研究两种易位染色体在不同小麦背景中的遗传稳定性及其通过雌雄配子的传递规律。DNA分子原位杂交结果表明,在杂种F_1花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(Pollen Mother Cell,PMC MI),两种易位染色体分别可以与对应的小麦染色体配对形成棒状二价体。正、反交结果分析表明,NAU418中的小片段顶端易位染色体T1AS·1AL-6VS通过雌配子和雄配子的传递率分别为8.00%~50.98%和7.89%~45.07%,NAU419中的小片段中间插入易位染色体T4BS·4BL-6VS-4BL通过雌配子和雄配子的传递率分别为29.17%~52.38%和7.69%~47.06%。表明2个易位系中的易位染色体都可以通过雌、雄配子传递,但是其通过雄配子的传递率均显著低于通过雌配子的传递率。     

Chromosomal location of genes for resistance to powdery mildew in common wheat (Triticum aestivum L. em Thell.) 7. Gene Pm29 in line Pova

Chromosomal localization and linkage mapping of a powdery mildewresistance gene were conducted in the resistant wheat line Pova, derivedfrom a Triticum aestivum cv. Poros-Aegilops ovata-alien additionline. Monosomic analysis revealed that a major dominant gene was locatedon chromosome 7D. This gene possessed a distinct disease response patternagainst a differential set of Blumeria graminis tritici isolates andsegregated independently from resistance gene Pm19 also located onwheat chromosome 7D. Molecular genetic analysis showed that theresistance gene in Pova was specifically located on the long arm ofchromosome 7D closely linked to one RFLP and three AFLP markers. It isproposed that the new gene be designated Pm29.     

Genetic and molecular organization of the short arm and pericentromeric region of tomato chromsome 6

We have previously presented an integrated linkage map of tomato chromosome 6, that showed the position of restriction fragment length polymorphism (RFLP) and randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers relative to a variety of classical markers. As for the short arm, map resolution has now been improved by crossing the chromosome 6 substitution line WSL6 to additional tester lines, carrying markers on the short arm. Molecular linkage analysis of the F₂ populations enabled us to produce an integrated linkage map showing the position of molecular markers relative to the classical markers Aps-1, yv, Mi, Cf-2/Cf-5, tl and pds. In order to incorporate the centromere into the integrated map, a radiation-induced deletion mapping strategy was applied, using irradiated pollen from L. pennellii LA716 in crosses to a L. esculentum line recessive for the markers yv and tl, that flank the centromere. Molecular analysis of the hemizygous yv-deletion and tl-deletion plants identified among the F₁ progeny, provided an estimate of the size of the respective deletions and, thus, of the position of the centromere relative to the molecular markers linked to yv and tl. This radiation mapping approach also provided evidence showing that, unlike published data, the root knot nematode resistance gene Mi as well as the Cladosporium fulvum resistance genes Cf-2/Cf-5 are located on the short arm.     

Identification for H. villosa chromatin in wheat lines using genomic in situ hybridization, C-banding and gliadin electrophoresis techniques

Detection of H. villosa chromosomes in telosomic addition and translocation lines of common wheat was undertaken using genomic in situ hybridization (GISH), C-banding techniques and polyacrylamide gels electrophoresis. The result of GISH on mitotic metaphase cells of the addition line `95039' indicated that the added telochromosomes originated from H. villosa, and it was probably 6VS or 7Vs of H. villosa according to the C-banding pattern. Furthermore, the analysis of gliadin profiles demonstrated that the telochromosome was 6VS. A pair of 1RS/1BL translocation chromosome was also found in `95039'. In addition, mitotic GISH analysis showed that the 6VS/6AL translocation chromosome remained unchanged after being transferred into new wheat background. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

用AFLP标记鉴定带有簇毛麦抗白粉病基因的小麦易位系

对４个小簇麦及小麦亲本和抗源供体簇毛麦进行了ＡＦＬＰ分析,确定了４个小簇麦是均含有一段簇毛麦ＤＮＡ的易位系。从得到的３个与该基因可能较紧密连锁的标记和７个不太紧密连锁的标记中,推测４个易位系中簇毛麦ＤＮＡ的长短不一样。文中还讨论了ＡＦＬＰ作为一种准确、快速鉴定易位系方法的可行性。