大规模悬浮培养茶叶细胞合成茶氨酸培养基组成优化研究

婺源绿茶嫩叶用MS培养基（加IBA 2βmg/L,6-BA 4βmg/L,盐酸乙胺25βmmol/L）进行茶叶愈伤组织悬浮培养,采用正交试验设计研究了培养基不同组成条件对茶叶细胞大规模悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示,整个培养周期中,细胞收获量和茶氨酸积累量峰值出现时间为培养的第19~22βd;在NH₄⁺/NO₃^- 1.0/60.0βmmol/L、K⁺ 100.0βmmol/L、Mg²⁺ 3.0βmmol/L、H₂PO₄^- 3.0βmmol/L、蔗糖30.0βg/L、水解酪蛋白2.0βg/L条件下,茶叶细胞生长量和茶氨酸积累量分别可达到16.33βg/100βml培养液和3.357βg/100βml培养液;提高培养基中水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得到延长,并有利于茶氨酸积累;H₂PO₄^-浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性,低H₂PO₄^-浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值,高H₂PO₄^-浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间;K⁺ 和蔗糖对细胞生长的影响均不明显;Mg²⁺对细胞生长产生明显的影响;NH₄⁺/NO₃^-对茶氨酸合成具有非常显著的影响。从生产效率考虑,培养周期以19~22βd为宜。     

茶氨酸酶促生物合成研究进展

茶氨酸系茶树（Camellia sinensis）特征性成分,具有放松镇静、增强记忆、保护神经、化疗调节等诸多生理活性。目前发现能催化茶氨酸生物合成的酶有7种,它们分别是茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酸合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶。茶氨酸生物合成反应有两种代表类型：（1）谷氨酸和乙胺为底物的连接合成反应（需ATP供能）;（2）谷氨酰胺和乙胺为底物的酰基转移反应。本文对茶氨酸酶促合成途径进行了综述,以此为茶氨酸微生物合成技术的开发应用提供参考依据。     

茶树发根中茶氨酸和儿茶素类含量的分析

茶树发根在LG₀培养基和添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基上生长迅速,但只在一个培养于LG₀培养基的发根克隆中检测到高含量的茶氨酸,含量达到23.12βmg/g鲜重,高于未转化根的18.77βmg/g鲜重。除茶氨酸外,该发根克隆中也检测到高含量的天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸。发根克隆培养于添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基,茶氨酸的含量则显著降低,说明培养基组成也是影响发根中茶氨酸的含量的因素之一。茶树发根中也含有少量的儿茶素类单体,主要为儿茶素和表儿茶素。     

配体交换色谱手性流动相法拆分和定量茶氨酸对映体

建立了配体交换色谱手性流动相法拆分茶氨酸对映体的方法。采用Polaris C₁₈柱;流动相为L-脯氨酸：Cu²⁺（摩尔比）为2:1,Cu²⁺浓度为0.5βmmol/L,pH6.8,甲醇的加入体积比为2%;波长254βnm;流速0.9βml/min;柱温30℃。L-茶氨酸的进样量在0.09542βμg~4.241βμg范围内峰面积与进样量之间线性关系良好,回收率在97.45%~100.4%之间;D-茶氨酸的进样量在0.08486βμg~4.243βμg范围峰面积与进样量之间线性关系良好,回收率在97.07%~100.1%之间。该方法通用,准确。     

茶氨酸的衍生化及毛细管电泳定量技术

采用胶束电动力学毛细管电泳技术定量茶氨酸,以2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂,建立茶氨酸定量的新方法。运行缓冲液为pH9.8的0.03βmol/L四硼酸钠缓冲液体系,分离电压为28kV,分离温度为17℃,在360βnm下进行检测。研究了不同pH、反应时间、反应温度、缓冲液浓度对衍生化反应的影响,确立了衍生化反应的最佳条件。证实了4℃和25℃环境下衍生化产物可以稳定保存5天。测定了茶氨酸衍生化方法的性能指标：线性范围为0.2~5βmmol/L（r²=0.993）,最低检测限为0.05βmmol/L。     

四川黑茶品质化学成分的研究

采用氨基酸自动分析法、高效液相色谱法分析了四川黑茶原料、渥堆叶、康砖成品茶的氨基酸、儿茶素组成含量及咖啡碱、茶多酚、水浸出物的含量。四川黑茶原料氨基酸含量为1424.00βmg/100g,必需氨基酸含量为547.00βmg/100g,茶氨酸含量为87.15βmg/100g,儿茶素含量为27.63βmg/g,咖啡碱、茶多酚、水浸出物含量分别为1.30%、8.18%、26.94%;渥堆叶氨基酸含量为1590.00βmg/100g,必需氨基酸含量为668.00βmg/100g,茶氨酸含量为67.62βmg/100g,儿茶素含量为27.52βmg/g,咖啡碱、茶多酚、水浸出物含量分别为1.24%、7.90%、24.53%;康砖成品茶氨基酸含量为1420.00βmg/100g,必需氨基酸含量为529.00βmg/100g,茶氨酸含量为66.88βmg/100g,儿茶素含量为13.65βmg/g,咖啡碱、茶多酚、水浸出物含量分别为1.27%、5.99%、23.92%。     

茯茶辅助调节血脂作用研究

以0.085βg/kg·bw、0.170βg/kg·bw、0.510βg/kg·bw低中高三种速溶茯茶的剂量饲喂Wistar大鼠30βd,结果表明茯茶具有降低Wistar大鼠体重、TC、TG以及升高HDL-C的作用。以茶水比为1:1β000浸提茯茶1βh制成茯茶饮料,以1β000βml/d剂量进行人体试饮34βd,结果显示,受试者TG下降显著,HDL-C上升显著,TC下降极显著,LDL-C亦有下降,但无显著性差异;受试者均无不良反应发生,血常规、血糖、肝肾功能均无异常变化。所制茯茶饮料在90βd内稳定,各项指标符合国家卫生标准。由此得出,茯茶具有很好的辅助调节血脂作用。     

茶尺蠖幼虫取食提高茶树儿茶素代谢响应强度

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶,测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害后3、6、12βh显著诱导了CsANR基因的相对表达水平,且在为害后3βh和12βh达到了极显著差异。CsLAR基因在茶尺蠖为害后6βh和12βh,与对照具有显著差异。茶尺蠖幼虫为害后24βh显著诱导了没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯含量的升高,而茶尺蠖为害后48βh仅没食子酸和没食子儿茶素的含量显著高于对照;儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯在茶尺蠖为害后24βh和48βh均没有被显著诱导。上述结果表明茶尺蠖幼虫为害提高了茶树儿茶素合成途径的代谢强度和儿茶素类化合物的积累。     

茶氨酸生物合成工程菌构建

通过PCR扩增E.coli DH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用Kpn I和Xho I双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coli BL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05βmol/L IPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0βU/g,大约是出发菌株E.coli DH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40βg/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coli DH5α提高了100多倍。     

普洱茶安全性毒理学评价研究概述

安全性毒理学评价是研究食品安全的重要手段。本文综述了与普洱茶有关的安全性毒理学评价研究,为认识普洱茶安全性提供参考。急性经口毒性实验显示普洱茶的半致死率（LD₅₀）大于5β000βmg·kg^-1,属于实际无毒级别;28βd或90βd经口毒性试验发现普洱生、熟茶提取物无明显不良效应的剂量分别是1β250和5β000βmg·kg^-1·d^-1;遗传毒性研究表明普洱茶对原核细胞、真核细胞和生殖细胞均无致突变性;普洱茶的生殖毒性和发育毒性无效应剂量水平是700βmg·kg^-1·d^-1;普洱茶对小鼠肝细胞的毒性极小或无;人体急性、亚急性毒性研究均未观察到病理改变。综上,已有安全性毒理学评价研究显示普洱茶具有较高的饮用安全性。     

叶面喷施氨基酸对茶叶中γ-氨基丁酸含量的影响

用不同种类、不同浓度氨基酸喷施茶树,采摘鲜叶并进行真空厌氧处理。比较分析不同处理对茶叶中γ-氨基丁酸(GABA)生物合成量、厌氧处理对茶样中各氨基酸含量以及施肥时间对GABA合成的影响。结果表明,茶树喷施氨基酸后,经真空厌氧处理茶鲜叶中γ-氨基丁酸含量明显上升,6种氨基酸对GABA合成的影响作用由高到低为谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸。茶鲜叶中氨基酸含量尤其是谷氨酸、天冬氨酸及茶氨酸含量高低可以作为评价GABA合成作用的指标;叶面喷施谷氨酸5d时,茶鲜叶中氨基酸总量以及谷氨酸、天冬氨酸和茶氨酸增加总量最高。综合分析确定施0.5%谷氨酸叶面肥5d后,采摘一芽二、三叶鲜叶,常温下厌氧处理8h,是生产γ-氨基丁酸茶的理想方法。     

茶氨酸制备和检测研究进展

本文综述了茶氨酸的特性、生物合成和化学合成途径、茶氨酸的分离制备以及检测方法,为茶氨酸的进一步开发利用研究提供相关信息。     

喷施溴氰菊酯对茶树主要特征性次生代谢物含量的影响

研究了不同浓度溴氰菊酯对茶树叶片中主要特征性次生代谢物含量的影响以及时间效应.结果表明:处理后2d,3种浓度的处理皆引起茶多酚含量显著低于对照,且随着处理浓度的增加降低幅度愈大,处理后8d,低浓度和推荐浓度处理的叶片降低幅度均达到最大,分别为19.4％和20.3％;喷施后2-8 d,3种浓度处理皆导致茶氨酸含量明显低于对照,低浓度和高浓度组均是在处理后8d降低幅度最大,分别达到18.3％和22.3％;喷施后2d和4d,低浓度的处理诱导咖啡碱含量显著升高,而推荐浓度与高浓度的处理却导致咖啡碱含量显著低于对照;在处理后10d,不同浓度处理的叶片中3种特征性代谢化物含量与对照相比,均相差不大.     

GC-MS及GC测定茶叶中主要游离氨基酸的方法研究

研究了N-（特丁基二甲基硅烷）-N-甲基三氟乙酰胺（≥95%;MTBSTFA）含叔丁基二甲基氯硅烷（1%;TBDMSCl）衍生、气相色谱（GC）和气相质谱联用仪（GC-MS）测定茶叶中游离氨基酸的方法,比较了衍生温度、时间、酸度及辅助试剂等对衍生效率的影响。以正缬氨酸为内标,乙腈为辅助衍生试剂,衍生温度110℃,衍生时间30 min,可以定量检测茶叶中主要的游离氨基酸。茶氨酸产生3个衍生峰,经质谱鉴定第1个峰（按出峰时间）为环状衍生峰,第2个峰为一个N端没有衍生,第3个峰为完全衍生峰。各氨基酸在10~1 000 nmol范围内线性良好（相关系数均大于0.99）,对茶叶样品测定结果与氨基酸自动分析仪基本一致,添加回收试验表明,茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸等的回收率为85%~108%。结果表明,试验建立的GC-MS及GC-FID方法操作简便、准确,重现性好,适用于茶叶中主要游离氨基酸的分离检测,同时GC-MS方法还可用于¹⁵N标记的氨基酸的检测,为吸收代谢实验提供研究基础。     

基因工程菌生物合成茶氨酸条件研究

研究了不同诱导条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,确定了较为优化的诱导表达条件;通过单因子试验研究了不同反应条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,研究结果表明反应体系中较高的菌体浓度对催化茶氨酸有一定的抑制作用;高L-Gln浓度可以提高茶氨酸的生成量,但是却降低了L-Gln的转化率;基因工程菌催化合成茶氨酸的最适pH是9.5左右,较为适合的反应温度是32℃~37℃。     

膜技术富集儿茶素渣中茶氨酸效应研究

以茶叶深加工中提制儿茶素后的废料—儿茶素渣为材料,在筛选出膜分离与富集茶氨酸最适料液pH值的基础上,比较研究了截留分子量为2500 Da、3500 Da、5000 Da的膜超滤儿茶素渣料液对茶氨酸得率与纯度的影响,以及300 Da纳滤、200 Da纳滤、反渗透、真空蒸发浓缩四种浓缩方法对茶氨酸的效应。结果表明:调节料液体系的pH值至2.8～3.5左右,有利于在超滤过程中分离与富集茶氨酸;选用截留分子量为3500 Da膜超滤儿茶素渣料液,茶多酚、水溶性碳水化合物等大分子物质大部分被截留,其截留率分别为89.90%、92.20%,可获得率为54.50%、纯度为8.92%的茶氨酸料液,300 Da纳滤、200 Da纳滤、反渗透、真空蒸发浓缩四种浓缩方法在加工茶氨酸中,茶氨酸损失率依次为4.51%、3.62%、0.45%、5.15%。综合考虑,利用3500 Da超滤分离与反渗透浓缩可以分离与富集儿茶素渣中的茶氨酸,综合得率与纯度分别为54.05%和8.53%,在生产上具有一定的可行性。     

茶氨酸生物合成基因工程菌的质粒稳定性研究

研究了茶氨酸生物合成基因工程菌重组质粒pET32a-GGT的稳定性。结果表明,该基因工程菌在连续传代100代后,质粒的目的基因片断没有缺失,具有结构稳定性;但在无抗生素选择压力下,连续传代20代后开始出现质粒丢失的细胞,连续传代100代后18%的细胞含有正常质粒,因此,表现出一定的分裂不稳定性。该基因工程菌在优化培养基和优化条件下的整个发酵过程中,始终表现出良好的结构和分裂稳定性,γ-谷氨酰转肽酶的活性为4.64U/ml,催化合成茶氨酸的产量为35.18g/L。     

酶工程技术在茶叶深加工中的应用及展望

根据前人研究成果从酶工程技术的研究角度出发,总结近年来该技术在茶叶深加工领域的应用,包括茶黄素、茶氨酸、儿茶素衍生物等茶叶天然产物的合成;茶多酚、茶多糖等天然产物的提取;速溶茶的加工和茶饮料的澄清、保香增香等方面,并对其应用前景加以展望。