鸡肠道大肠杆菌多抗菌株C20耐药性基因的预测和分析

为揭示动物源大肠杆菌耐药性机制,追踪潜在的抗性基因传播机制及其来源,在先前公布的分离自鸡肠道的多抗耐药性菌株大肠杆菌Escherichia coli C20基因组基础上,对E.coli C20抗生素抗性基因种类、数量、来源及其耐药性机制进行分析。通过与已知的抗生素抗性基因数据库进行对比和注释,一共预测和注释了80个潜在的耐药性基因,包括与先前筛选的7种抗生素抗性对应的抗性基因。其中,喹诺酮类抗生素抗性基因位于C20基因组上,四环素、磺胺类、氯霉素、氨基糖苷类以及大环内酯类抗生素的抗性基因则位于C20环状质粒分子上。基因组聚类分析表明,菌株C20与大肠杆菌K-12菌株DH1、BW2952和MG1655亲缘关系较近,序列相似性97%~99%。3株K-12菌株基因组中没有发现与C20质粒类似的序列,表明C20菌株的抗性基因主要是通过质粒介导的水平基因转移方式从其他环境微生物中获得。     

健康鸡猪体内大肠杆菌对四环素的耐药性及耐药基因分布

【目的】四环素作为人类和动物临床上广泛使用的广谱抗生素,其耐药性问题一直为全球所关注。健康动物体内的共生性大肠杆菌作为耐药指示菌和耐药基因的贮存库,了解其对四环素的耐药性及耐药机制对于疾病的防控具有重要意义。【方法】从健康鸡、猪体内分离大肠杆菌,用微量肉汤法检测其对四环素的耐药性,并用PCR方法对耐药菌株中8种四环素耐药基因的携带情况进行调查,运用统计学方法分析鸡、猪体内大肠杆菌分离株的耐药性和耐药基因分布情况的差异。【结果】总共分离鉴定出大肠杆菌269株,其中86.2%的菌株对四环素产生了耐药性,健康猪体内大肠杆菌分离株的耐药性明显高于健康鸡体内分离株(P0.05)。tet(A)、tet(B)和tet(M)3种四环素耐药基因广泛存在于健康鸡、猪体内的共生大肠杆菌中,所携带比例分别为87.9%、28.4%和15.5%;所有对四环素耐药的大肠杆菌均携带tet(A)或tet(B)基因,其中25.0%和2.6%的耐药菌株分别携带有2种和3种耐药基因,tet(M)基因与tet(A)或tet(A)+tet(B)基因共存于对四环素耐药的大肠杆菌中;健康鸡、猪体内耐药性大肠杆菌在tet(A)+tet(M)基因携带率方面的差异具有统计学意义(P0.01)。【结论】健康鸡、猪体内的大肠杆菌分离株普遍对四环素耐药,四环素耐药基因广泛分布于大肠杆菌分离株中,大肠杆菌对四环素的耐药机制以主动外排作用为主,核糖体保护基因在大肠杆菌对四环素耐药机制方面的作用尚待进一步的研究。     

氮磷营养盐对大肠杆菌四环素耐药性的影响

根据临床和实验室标准协会（clinical and laboratory standards institute, CLSI）推荐的微量肉汤稀释法检测泥样中大肠杆菌对四环素的敏感性,并应用PCR法检测四环素耐药基因tetA,tetB,探讨氮磷营养盐对大肠杆菌四环素耐药性影响的可能机制。结果表明：添加不同剂量氮磷营养盐能够导致大肠杆菌对四环素产生耐药性,但大肠杆菌的耐药率与剂量间无明显相关性。37株高耐药率大肠杆菌tetA基因的阳性率为100%,66株低耐药率大肠杆菌tetA基因的阳性率为16.67%,而16株对药物敏感的大肠杆菌未检测到tetA基因;但供试大肠杆菌均未检测到tetB基因。这表明,氮磷营养盐诱导的大肠杆菌四环素耐药性与tetA基因有关。     

猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coli F18菌株感染下表达量极显著上调的microRNAs-miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守性,TargetScan预测miR-192和miR-215的靶基因,并对靶基因分别进行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,进一步利用DAVID对靶基因蛋白进行功能分类,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的断奶仔猪E.coli F18感染抗性相关的调控基因取交集。【结果】miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪十二指肠和空肠中均高度表达,二者成熟序列在脊椎动物中高度保守。miR-192和miR-215对应的靶基因相同,具有156个靶基因,只在轴突导向通路（axon guidance pathway）显著富集（P-value < 0.05）以及25个GO功能中显著富集（P-value < 0.05）。靶基因蛋白按功能分为12类,其中信号转导功能的磷蛋白（phosphoprotein）和DNA结合蛋白（dna-binding）占主要部分。靶基因与前期筛选的E.coli F18感染抗性相关的调控基因（GEO登录号：GSE26854）取交集,发现DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3 等5个基因为miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5为维持小肠上皮细胞结构完整性的重要因子。【结论】miR-192与miR-215是参与维持断奶仔猪肠道正常功能与抗F18大肠杆菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染中关键的靶基因,今后需要进一步验证其能否作为梅山猪抗F18大肠杆菌的有效遗传标记。     

差异显示技术分析脾脏中仔猪腹泻抗性基因

大肠杆菌引发的仔猪腹泻是养猪生产中存在的普遍疾病,是影响养猪业经济效益 的重要因素。本实验以发病和未发病的仔猪脾脏为对照,进行差异显示研究,筛选仔猪腹泻抗 性相关特异表达基因。在脾脏未发病池中检测到一条与Nck转导蛋白同源的特异表达EST、序 列;作为信号转导蛋白,Nck通过活化免疫细胞,在免疫系统中发挥作用。同时,Nck也是大肠 杆菌附着在小肠上皮细胞,并释放毒素这一过程中的一个关键因子。大肠杆菌粘附在小肠上产 生的信号可能是通过Nck传至中枢免疫器官,引发T细胞的大量细胞增殖、转换、分化和程序 性死亡,从而为积极防御外界抗原做准备。     

临床分离大肠杆菌磺胺敏感性及磺胺抗性相关基因的检测

对分离自中国东北牛(n=181)、猪(n=182)、鸡(n=146)和鹌鹑(n=55)的粪便及病变器官的564株大肠杆菌菌株进行磺胺敏感性与磺胺抗性基因检测。分别用肉汤微量稀释法和聚合酶链式反应检测磺胺敏感性和磺胺抗性基因。结果表明:在564株菌株中,235(41.7%)株对磺胺试剂敏感,329(58.3%)株对磺胺甲恶唑有抗性,190(33.7%)株对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑有抗性;不同动物分离株的磺胺抗性比例不同,从牛、猪、鸡和鹌鹑中分离到的菌株int1基因的比例分别是12.2%、44.5%、40.4%、18.2%,sul1基因比例分别是5.5%、37.4%、28.1%、3.6%,sul2基因比例分别是39.2%、25.3%、29.5%、10.9%,但在牛、鸡、鹌鹑源菌株中未检测到sul3基因,在182株猪源大肠杆菌中检测到13株(7.1%)sul3基因阳性菌株。菌株的磺胺抗性与其包含的抗性基因之间不完全吻合。     

Genome-wide experimental determination of barriers to horizontal gene transfer

Horizontal gene transfer, in which genetic material is transferred from the genome of one organism to that of another, has been investigated in microbial species mainly through computational sequence analyses. To address the lack of experimental data, we studied the attempted movement of 246,045 genes from 79 prokaryotic genomes into Escherichia coli and identified genes that consistently fail to transfer. We studied the mechanisms underlying transfer inhibition by placing coding regions from different species under the control of inducible promoters. Our data suggest that toxicity to the host inhibited transfer regardless of the species of origin and that increased gene dosage and associated increased expression may be a predominant cause for transfer failure. Although these experimental studies examined transfer solely into E. coli, a computational analysis of gene-transfer rates across available bacterial and archaeal genomes supports that the barriers observed in our study are general across the tree of life.     

河南省鸡致病性大肠杆菌耐药性质粒的研究

对河南省32个县市的93株鸡致病性大肠杆菌进行耐药性质粒的分析,并对其中12株100%耐庆大霉素(GM)的菌株进行耐药质粒的转化试验,成功获取了2个转化子。质粒检测结果表明:93株鸡致病性大肠杆菌可以分为49种质粒图谱类型,质粒电泳条带最多6条,最少1条,其中质粒图谱为1条条带的菌株占测试菌株的45.16%;同一地区、同一鸡场菌株的质粒图谱相同或相似,不同地区菌株的质粒图谱不同,但它们之间会有相同或相近的少量流行质粒存在。质粒转化结果表明:同一质粒可编码1个至数个抗药性基因,不同质粒可以携带相同或不同的抗性基因,证明了质粒可以传递多种耐药性,细菌的抗药性与抗药性质粒的转移有很大关系。     

鸭源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的流行调查

[目的]了解我国部分地区鸭源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR在临床菌株中的流行情况。[方法]采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的肉汤微量稀释法测定22株鸭大肠杆菌对氟苯尼考等9种药物的敏感性,并应用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR。[结果]22株鸭源大肠杆菌对氟苯尼考和四环素全部耐药,耐药率达100%,呈现多重耐药性特点;其氟苯尼考耐药基因floR检出率为90.9%,与耐药表型基本一致。[结论]氟苯尼考在我国部分地区呈现高耐药性,对其耐药基因的监测为临床抗菌药物的合理使用提供了理论依据。     

辽宁地区猪源大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测与分析

为了解辽宁地区猪源大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药情况,采用K-B纸片法对65株猪源大肠埃希菌菌株进行6种氨基糖苷类抗生素的药敏试验,同时采用PCR方法对耐药菌株rpsl基因和4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aad A、aac(6')-Ⅰb-cr、aac C4进行检测及序列分析,并将阳性样品与Gen Bank中登录的序列进行同源性比较。结果显示,辽宁地区猪源大肠埃希菌对链霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素的耐药率分别为26.2%、15.4%、18.5%、29.2%、4.6%、21.5%;23株耐药菌株rpsl基因检出率为100%;4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aad A、aac(6')-Ⅰb-cr、aac C4检出率分别为13.0%、8.7%、69.6%、4.3%。以上结果表明,在氨基糖苷类抗生素中耐药性最低的是丁胺卡那霉素,rpsl基因及氨基糖苷类钝化酶基因普遍存在于辽宁地区猪源大肠埃希菌中。     

Molecular and Physical Mapping of Powdery Mildew Resistance Genes and QTLs in Wheat: A Review

Wheat powdery mildew(Pm) is a major disease of wheat worldwide. During the past years, numerous studies have been published on molecular mapping of Pm resistance gene(s) in wheat. We summarized the relevant findings of 89 major resistance gene mapping studies and 25 quantitative trait loci(QTL) mapping studies. Major Pm resistance genes and QTLs were found on all wheat chromosomes, but the Pm resistance genes/QTLs were not randomly distributed on each chromosome of wheat. The summarized data showed that the A or B genome has more major Pm resistance genes than the D genome and chromosomes 1A, 2A, 2B, 5B, 5D, 6B, 7A and 7B harbor more major Pm resistance genes than the other chromosomes. For adult plant resistance(APR) genes/QTLs, B genome of wheat harbors more APR genes than A and D genomes, and chromosomes 2A, 4A, 5A, 1B, 2B, 3B, 5B, 6B, 7B, 2D, 5D and 7D harbor more Pm resistance QTLs than the other chromosomes,suggesting that A genome except 1A, 3A and 6A, B genome except 4B, D genome except 1D, 3D, 4D, and 6D play an important role in wheat combating against powdery mildew. Furthermore, Pm resistance genes are derived from wheat and its relatives, which suggested that the resistance sources are diverse and Pm resistance genes are diverse and useful in combating against the powdery mildew isolates. In this review, four APR genes, Pm38/Lr34/Yr18/Sr57, Pm46/Lr67/Yr46/Sr55, Pm?/Lr27/Yr30/Sr2 and Pm39/Lr46/Yr29, are not only resistant to powdery mildew but also effective for rust diseases in the field, indicating that such genes are stable and useful in wheat breeding programmes. The summarized data also provide chromosome locations or linked markers for Pm resistance genes/QTLs. Markers linked to these genes can also be utilized to pyramid diverse Pm resistance genes/QTLs more efficiently by marker-assisted selection.     

细菌铜抗性机制研究进展

硫化铜矿生物冶金过程中,由于高浓度铜离子对浸矿细菌具有毒性,抑制了细菌的浸矿活性.一些细菌,如丁香假单胞菌、大肠杆菌、肠球菌存在铜抗性机制.在丁香假单胞菌中.铜抗性是由4个结构基因copABCD和2个调节基因copRS控制的.在大肠杆菌中与之相似的基因被称为pcoABCD和pcoRS.pcoABCDRS的基因产物与copABCDRS的基因产物的氨基酸相似性分别达到76%,55%,60%,38%,61%,和30%.在大肠杆菌pcoABCDRS的末端还有一个pcoE基因,其功能目前还不清楚.另外,大肠杆菌的铜抗性还受染色体基因的调控.G+肠球菌的铜抗性机制研究的最清楚,其操纵子基因包括copYZAB,copYZ为调节基因.肠球菌copAB编码的蛋白CopA和CopB为P型ATP酶,分别负责铜的摄入和排出.对细菌铜抗性机制的研究进展进行了论述.对于浸矿细菌铜抗性基因工程改造具有理论指导意义.     

大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。     

猪源致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因及抗菌药耐药性的调查

【目的】探讨猪大肠杆菌病分离的E.coli的优势血清型与毒力基因和耐药性的相关性。【方法】采用玻片凝集法测定了猪大肠杆菌病有关的血清型分布,PCR方法调查7种毒力相关基因,用微量稀释法测定了所有菌株对18种抗菌药的敏感性。【结果】超过一半的菌株含有astA,Stx2e和eaeA基因,且毒力基因组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行。定型菌株53株,分别属于15个不同的血清型,其中O8和O64为主要流行的血清型。O8型菌株中,所有均携带astA基因,多数耐四环素、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑,但对安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感;而O64型菌株中,多数携带astA和Stx2e基因,所有对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑耐药,但对多黏菌素E和卡那霉素敏感。【结论】O8和O64为主要流行的血清型,两种血清型菌株拥有相似的毒力基因谱和耐药表型,但有不同的敏感表型。     

大肠杆菌中dctA基因敲除及其苹果酸摄取功能鉴定

大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p KD46感受态细胞,筛选具有氯霉素抗性的基因敲除突变株E.coliΔdctA/p KD46。通过消除质粒p KD46构建大肠杆菌dctA基因敲除突变株E.coliΔdctA。构建dctA基因表达载体p Easy T3-dctA。通过苹果酸摄取功能互补试验,证实基因敲除菌株E.coliΔdctA丧失摄取苹果酸功能,四碳-二羧酸摄取蛋白Dct A具有摄取苹果酸功能。研究首次报道Dct A具有摄取苹果酸功能,该基因敲除突变株的构建可为其他菌株来源2-HCT转运蛋白的基因克隆与功能分析奠定基础。     

广东地区鱼源大肠埃希菌ESBLs和PMQR流行分布调查

从广东地区食用鱼肠道分离鉴定了218株大肠埃希菌,用琼脂稀释法测定218株大肠埃希菌对17种抗菌药物的敏感性,并用PCR方法调查ESBLs和PMQR基因的流行分布情况.对10株β-内酰胺酶(包括ESBLs)和/或PMQR阳性菌株进行了接合转移试验,探讨ESBLs和PMQR基因的传播机制.敏感性测定结果显示:218株大肠埃希菌对17种抗菌药物的耐药率为0.5%～72.5%.在112株氨苄西林耐药菌株中,检测出2种ESBLs基因,分别为blaCTX-M-79和blaCTX-M-14,2株菌中还检测到β-内酰胺酶基因blaLEN-4和blaLEN-17.在80株环丙沙星耐药菌株中,检测到59株为PMQR阳性,分别为qnrB(33株),qnrD(5株),qnrS(21株),aac(6’)-Ib-cr(6株).接合转移试验结果表明,ESBLs和/或PMQR基因可同时存在于一个质粒上进行转移.     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscC基因缺失株的构建

[目的]构建未引入任何遗传标记物的溶藻弧菌vscC基因框内缺失突变株。[方法]首先以溶藻弧菌ZJ51-O基因组DNA为模板,用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)扩增法构建体外vscC基因缺失片段;扩增产物经酶切后连接至自杀质粒pDM4,再转化入大肠杆菌SY327进行克隆,筛选阳性克隆子并进行PCR分析鉴定;提取阳性克隆子的自杀重组质粒pDM4-△vscC,用热休克法将其转入到大肠杆菌S17-1中,再经接合生殖的方式将自杀重组质粒导入溶藻弧菌ZJ51-O菌株中,利用抗生素筛选策略与蔗糖反向筛选系统,挑选疑似目的突变菌株,最后利用PCR鉴定与测序分析进行确证。[结果]溶藻弧菌ZJ51-O的vscC基因框内缺失突变株构建成功。[结论]该研究为进一步研究vscC基因的功能和T3SS在溶藻弧菌致病过程中所起的作用奠定基础,同时也为溶藻弧菌的其他基因突变株的构建和研究提供了参考和试验经验。     

溶藻弧菌III型分泌系统vscC基因缺失株的构建(英文)

[目的]构建未引入任何遗传标记物的溶藻弧菌vscC基因框内缺失突变株。[方法]首先以溶藻弧菌ZJ51-O基因组DNA为模板,用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapext ension PCR,SOE-PCR)扩增法构建体外vscC基因缺失片段;扩增产物经酶切后连接至自杀质粒pDM4,再转化入大肠杆菌SY327进行克隆,筛选阳性克隆子并进行PCR分析鉴定;提取阳性克隆子的自杀重组质粒pDM4-△vscC,用热休克法将其转入到大肠杆菌S17-1中,再经接合生殖的方式将自杀重组质粒导入溶藻弧菌ZJ51-O菌株中,利用抗生素筛选策略与蔗糖反向筛选系统,挑选疑似目的突变菌株,最后利用PCR鉴定与测序分析进行确证。[结果]溶藻弧菌ZJ51-O的vscC基因框内缺失突变株构建成功。[结论]该研究为进一步研究vscC基因的功能和T3SS在溶藻弧菌致病过程中所起的作用奠定基础,同时也为溶藻弧菌的其他基因突变株的构建和研究提供了参考和试验经验。     

几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因克隆微生物表达和抑菌效果研究

采用PCR扩增的方法,扩增获得几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的基因,分别将其基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,构建了原核表达载体pETChi和pETGlu。经IPTG诱导后几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达。通过对连孢(Alternaria alternate)的抑菌实验表明,这两基因的表达产物对此真菌有较强的抵抗能力。