转基因动物研究进展

Ｇｏｒｄｏｎ等（１９８０）将重组ＤＮＡ用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的转基因小鼠，此后的十几年中，建立了许多整合有外源基因的转基因小鼠和大鼠、转基因兔、猪、羊、牛，使得转基因动物这一技术在基础研究和实际应用方面展示出良好的前...     

转PRL基因小鼠遗传性状分析

本研究以原核注射法生产的乳腺特异性表达PRL基因小鼠为模型,从外源基因遗传完整性、拷贝数和插入位点3方面对其进行遗传性状分析,为今后大型转基因动物的选育提供基础。采用基因组DNA PCR方法筛选发生外源基因片段部分缺失的小鼠,并进行Southern blot验证,以检测外源基因的遗传完整性;用绝对荧光定量PCR方法测定外源基因拷贝数,用Genome walking方法分析外源基因整合位点。结果显示,外源基因片段部分缺失率为1.91%;整合十几个拷贝外源基因的小鼠在便携UV灯下可见绿色荧光,整合2个拷贝的小鼠无绿色荧光;在NW_001073945.1序列的2 025~2 026bp和NW_001030574.1序列的10 760 020~10 760 021bp处插入的外源基因可正常表达。以上结果说明,外源PRL基因在原核注射法生产的转基因小鼠中可稳定遗传;在一定范围内,外源基因的表达量与拷贝数呈正相关;附近无其他基因的外源基因插入位点有利于外源基因的表达。     

体内A型精原细胞介导转MxA基因小鼠的制备

本研究旨在探讨内源性A型精原干细胞介导法制备转抗黏液病毒基因A(Myxovirus resistance gene,MxA)基因小鼠的可行性。将pcDNA-MxA质粒和新型转染试剂ExGen500混悬后分5点注射至7日龄的ICR公鼠两侧睾丸组织内,睾丸内基因注射(testis gene transfer,TGT)鼠在性成熟后的不同阶段(6、12及24周龄)与正常母鼠交配,检测后代外源基因整合及表达情况,选取表达MxA基因的小鼠进行H5N1亚型禽流感病毒攻毒试验,观察小鼠的健康状况并观察肺及气管的组织病变情况。结果表明,TGT鼠和正常母鼠交配后能稳定产生转基因后代小鼠,2只TGT鼠在6、12及24周龄交配后代整合率分别为11.11%(2/18)、11.76%(2/17)、11.54%(3/26)及13.64%(3/22)、13.33%(2/15)、11.76%(2/17)。2只TGT鼠后代外源基因平均整合率分别为11.47%及12.91%,之间差异不显著(P0.05)。RT-PCR检测表明,MxA基因整合小鼠中有21.43%(3/22)测到MxA的表达;所制备的MxA表达鼠H5N1亚型禽流感病毒攻毒后全身症状、肺及气管病变程度明显比正常鼠轻。试验结果表明体内精原干细胞介导的转基因方法是一种可行的、具有很大应用前景的转基因方法,制备的转MxA基因小鼠对H5N1亚型禽流感病毒具有一定的抵抗力。     

β干扰素转基因小鼠的建立和特性研究

选择ICR小鼠为受试动物,应用显微注射仪,将线状人β干扰素基因,按2940～10000拷贝,1～3pL的剂量注射到供体受精卵的雄前核,然后移植到假孕受体的输卵管。实验先后注射了301个受精卵,移植到20只假孕受体,其中5只妊娠,产仔25只。从所获得的25只亲代小鼠的尾组织提取DNA,用内切酶BamHI消化,以[α-~(32)P]-dCTP标记的上述外源基因为特异性核酸探针,应用DNA印迹法检测这些小鼠DNA内外源基因的整合状况.结果表明,亲代小鼠中有人β干扰素基因重组子的转基因小鼠,杂交带在6.8kb位置。应用上述同样方法对亲代转基因小鼠的子1代组织DNA检测发现,绝大多数小鼠的标本除见到1条1.8kb人β干扰素基因的较弱杂交带外,还有数条5.0kb以上强弱各异的杂交带,表明这种外源基因不仅整合到了亲代小鼠的遗传物质内,而且可经垂直方式传给子代。人β干扰素基因的鼠体水平表达检测发现,1只子1代转基因小鼠的肿瘤组织浸出液中含有人β干扰素,滴度达160U/mL,表明整合在小鼠DNA内的人β干扰素外源基因不经诱导而有一定表达。     

不同杂交方式获得高效表达乙肝病毒基因转基因小鼠

转基因动物普遍存在转基因效率低、表达水平不高并且外源基因遗传不稳定等问题。根据传统育种原理，笔者在已经得到的转基因动物基础上，寻找比原代外源基因表达水平更高的后代，不仅可解决上述问题，而且可以节约成本，缩短获得高效表达转基因动物的时间。本研究是以繁殖周期短，易操作，较经济的小鼠作为试验模型，对已整合有人的乙肝病毒(Hepatitis B Virus，HBV)基因的小鼠进行近交和远交的方法进行选育，并对选育的后代进行外源基因的整合检测以及对小鼠血清中表达的外源基因进行定量检测，表明获得了高效表达的转基因小鼠，从而为以后的转基因动物研制提供了实践和科学依据。     

动物基因转移技术

Grodon首先于1980年报道,转移克隆化的外源DNA到小鼠体中,而使小鼠的所有细胞都含有外源基因。随后又有很多类似报道,被整合的外源基因,即转基因被稳定地整合到转基因动物的基因组中,并按孟德尔方式遗传。然而,转基因动物内在的潜力却首先是由Palmiter等(1982)证明的。他们发现,当转移到小鼠体内的生长激素基因表达时,明显增加了生长速度。近十年来,转基因小鼠通常都用做研究工具,很多实验室试图应用这一技术来改变家畜的基因型。到本世纪末或下世纪     

家蚕转基因方法及研究进展

转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在动物基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 1 980年Ｇｏｒｄｏｎ等将胸腺激酶 (ＴＫ)基因和ＳＶ40病毒基因片段的融合基因通过微注射技术导入到小鼠的受精卵中 ,发现ＴＫ基因整合到了小鼠的染色体中 ;随后相继的类似研究发现整合到小鼠染色体中的外源基因能够遗传给后代。 1 982年Ｐａｌｍｉｔｅｒ等采用转基因技术培育出了携带有人生长激素 (ｈＧＨ)的转基因小鼠 ,由于小鼠具有很快的生长速度 ,个体较正常小鼠大二倍以上 ,成了当时轰动一时的“巨型小鼠”。超级小鼠的成功 ,标志着转基因动…     

转基因动物研究及其在医药和畜牧业上的应用

动物转基因技术一种是将外源基因转移到动物受精卵中,使其整合和表达,以产生具有新遗传特性的动物;另一种是将外源基因在特定调控元件作用下,在一定时间内表达外源蛋白。而转入的外源基因通常有4类:参与编码和调节机体组织生长发育的基因;与动物生产力密切相关的经济性状的主效基因;培育出抗某些疾病或具有广谱抗病性品系的抗性基因;治疗人类疾病所需的蛋白基因[1,2]。     

家畜基因转移的研究及进展

<正> 家畜的基因转移是指用物理学的、化学的和生物学的方法,将外源基因导入受精卵中,与动物的染色体稳定地整合在一起,成为受体动物的遗传结构并获得表达,同时能随着动物的繁殖稳定地遗传给后代动物.自从Mintz(1979)成功地将猿猴病毒40的DNA转入小鼠的胚胎,获得第一个转基因小鼠     

哺乳动物的基因转移

遗传工程是70年代从分子生物学发展起来的一门新技术,作为基因工程是对DNA上的基因进行体外操作,把不同来源的基因按照设计蓝图构建成一个新的融合基因(Fusion ge-ne),然后导入细胞中,产生具有新的遗传特性的生物。胚胎操作和基因工程技术的结合为哺乳动物基因工程开辟了前景,基因工程的应用涉及到目的基因的分离、重组、转移、整合和表达等一系列过程。在哺乳动物的应用研究中,首先把SV40病毒DNA整合到小鼠的基因组中(Jaenisch等,1974)。Munro(1968)利用鸡进行了外源基因导入动物染色体的研究,并且取得了基因转移成功,但当时没有引起重视。进入80年代以后,利用微注射(Mi-     

转基因技术在动物饲养上的应用

动物转基因技术是20世纪80年代初发展起来，主要就是将外源基因或体外重组的基因结构转移到动物受精卵内组成新的融合基因。使其在动物体内整合和表达，产生具有新的遗传特征或性状的动物，并能将新的遗传信息稳定遗传给后代，获得转基因系或转基因群体，或者将外源基因在特定调控元件作用下在某些宿主组织中进行独立的复制，并在一定时间内表达外源蛋白。前者是永久性地表达，又称为整合表达，这种表达可以遗传，对改变动物的性状意义重大。后者是暂时性表达，不能遗传给后代，只在当代表达，这种表达为动物疾病进行基因治疗和基因预防奠定了理论基础。     

天蚕抗菌肽B基因嵌合表达载体的构建及其对桑树和烟草的转化研究

<正> 致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种天然的植物转化系统。根据其Ti质粒(Tumor Inducing plasmid)转移整合的分子机制,已构建了一系列外源基因的嵌合表达载体,并在一些植物中表达这些外源基因。 谢毅等按照植物偏爱的遗传密码子编码,已人工合成了天蚕抗菌肽B基因。此抗菌肽B是一种具有广谱性很强的体内外杀菌作用的昆虫免疫多肽。可广泛用于各种经济作物的抗细菌病     

跨膜蛋白66生物信息学分析及其突变体转基因小鼠构建

跨膜蛋白66(TMEM66)是与细胞凋亡以及癌症发生密切相关的重要功能基因,为了在个体水平研究其生物学功能,我们进行了TMEM66基因突变体(TMEM66V)转基因小鼠的构建。本研究通过原核注射法进行转基因操作,将获得的312个受精卵移植到13只代孕母鼠中,运用PCR、Southern blotting对出生的小鼠进行转基因鉴定,对于转基因阳性小鼠通过传代试验研究外源基因是否稳定整合,并通过反向PCR方法研究外源基因的整合方式。结果显示在出生的55只小鼠中有6只为转基因阳性,其中3只转基因小鼠可以稳定传代,表明这些小鼠中外源基因发生了稳定整合。反向PCR检测结果发现外源片段是以串联重复的方式整合到转基因小鼠的基因组中。本研究成功构建了TMEM66基因突变体转基因小鼠,为进一步研究TMEM66基因的功能奠定了基础。     

猪白介素-4重组表达质粒在小鼠体内的组织分布及环境释放安全性

为了探讨pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒作为疫苗佐剂进入临床应用的生物安全性,本试验就pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒在小鼠体内的组织分布和环境释放安全性进行了研究.将pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒经肌肉途径免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间剖杀动物并摘取各种组织,抽提基因组DNA.利用PCR技术分析其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性,同时检测了免疫动物现场环境,以监测pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒上的猪IL-4基因、CMV启动子基因和抗性基因是否在环境细菌中发生转移和扩散.结果表明,免疫后1 d在3/3小鼠各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫后5 d仅有1/3小鼠于注射部位肌肉中存在重组表达质粒,免疫后15 d所有小鼠的各组织中无重组表达质粒存在;未发现pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中.因此,认为pcDNA3.1/IL-4重组表达质粒对动物和环境是安全的.     

转基因技术的应用

转基因动物技术就是将外源基因或体外重组的基因结构转移到动物受精卵内组成一个新的融合基因，使其在动物体内整合和表达，产生具有新的遗传特征或性状的动物，并能将新的遗传信息稳定遗传给后代，获得转基因系或转基因群     

转基因小鼠的制备

近二十年来,分子生物学研究获得了长足的发展,而其核心部分基因工程技术的发展尤为突出,特别是转基因动物技术的出现,它不仅为人们研究外源基因在整体动物中的表达调控规律提供了最为有效的手段,而且还可通过改变动物的基因型,使其表现型更符合人类的需要,以培育优良品种及生产人类所需的有生物活性的蛋白质.因此,动物的基因转移这一生物技术已经广泛地应用于生命科学研究的众多领域.所谓转基因动物是指用实验手段将特定外源基因导入动物早期胚胎细胞,由此整合到染色体上,并通过生殖细胞系传递给后代的一类新动物.常见的转基因方法有DNA显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒转染法、精子载体法、电转移法等,其中以DNA显微注射法最为成熟,使用最广泛、最可靠,该法常用的哺乳动物是实验小鼠.本文所要介绍的就是显微注射法制备转基因鼠所涉及的关键技术和原理(一般程序如图1所示).     

山羊基因转移工程中供体超排后取卵时间的探索

<正> 进行家畜基因转移工程时,为了提高基因整合率和表达率,必须将外源基因注入受精卵的原核内。而基因转移技术在家畜中的应用主要受卵核观察困难的限制。取卵过早,卵子尚未排出或已排还没有受精,有时虽已受精,但并不能见到原核。取卵过迟,则过了原核期。这些情况都给基因注射带来困难。至今国     

水平显微注射法制备转基因小鼠的研究

由于传统显微注射法具有操作繁琐、技术要求高和外源基因导入率低等局限性,本试验对常规显微注射法进行改进,旨在建立一套比较完善的水平显微注射方法。采用水平微注射系统,将外源DNA片段导入胚胎的雄原核中,获得子代鼠,分娩后3周提取鼠尾基因组DNA,PCR法筛选转基因阳性鼠。本试验采用Puc/BLG IN S和Chym os in基因,共使用710枚鼠原核胚进行研究,胚胎经注射后移植了25只受体,产下仔鼠77只;妊娠率分别为33.3%(5/15)和50%(5/10),胚胎成活率分别为9.47%(41/433)和l3.00%(36/277),阳性率分别为4.88%(2/41)和8.33%(3/36)。将阳性雌鼠配种妊娠后,对外源基因整合情况进行检测,结果表明初步获得了转基因阳性小鼠。     

动物乳腺生物反应器的原理及研究进展

1基本概念1.1转基因动物(transgenic animal)转基因动物是指通过实验的某些方法,将人为构建的外源目的基因导入动物的生殖细胞或早期胚胎(原核或受精卵),使其稳定地整合到动物基因组中,并能遗传给后代的动物。最早的转基因动物是鸡(munro,1968),其后是转基因鼠(Jaenish1974注射法,1976病毒感染法)。Palmiter等人在1982年将含金属巯蛋白基因启动子的DNA片断与大鼠生长激素基因融合,用注射法移入小鼠受精卵,经移植产下21只仔鼠,6只表达,10周龄时体重比同窝正常鼠大一倍,成为世界第一批超级鼠,引起巨大轰动。此后,相继获得多种基因、多畜种、…     

转基因动物细胞中外源基因整合位点的分析

旨在通过测定转基因动物中外源基因在宿主染色体上的整合位点来阐述外源基因的整合机制及对该过程中出现的有关问题进行讨论。本研究以MYF6(Myogenic factor 6)转基因小鼠及FAT-1转基因牛为试验材料,采用TAIL-PCR(热不对称交互式PCR)、hiT AIL-PCR(高效热不对称交互式PCR)及本试验室改进的hiT AIL-PCR法,对转基因动物进行了外源基因的整合位点的检测及测序分析。本研究检测到3个MYF6转基因小鼠和一个FAT-1转基因牛的外源基因插入到染色体上的片段,还获得了大量的未能整合到染色体上的PCR片段。通过对以上片段的测序分析,我们发现重组质粒并不一定是在酶切位点断裂,重组质粒可以发生随机断裂,首尾相连等,外源基因整合如宿主染色体,可以同源重组的方式进行整合,也可以进行随机插入。同时,发现并分析了在转基因动物检测中可能存在的问题。通过对外源基因在转基因动物体内整合位点的分析,能够明确转基因动物的遗传背景,能够为转基因动物的生产提供帮助。