红松SRAP-PCR反应体系的优化

通过单因素试验,对红松SRAP—PCR反应体系的主要影响因子（Taq DNA聚合酶、Mg^2＋、模板DNA、dNTPs、引物浓度）进行了优化筛选,得出红松SRAP—PCR反应的最佳体系：20μL反应体系中,模板90ng,Mg^2＋1．0mmol／L,dNTPs0．15mmol／L,Taq DNA聚合酶1．5 U,引物0．3～0．4μmol／L。     

闽楠基因组DNA提取及RAPD反应条件优化

以闽楠叶片为材料，研究了闽楠基因组DNA提取方法及RAPD反应条件。采用改良的CTAB高盐法提的DNA质量较高，适宜RAPD-PCR分析。在20μL反应体积中，RAPD分析的优化反应体系为：2mmol/L的Mg^2 ，200μmol／L dNTP，1，5ng/μL的模板DNA，1UTap酶，50nmol／L引物。     

均匀设计优化兴安落叶松ISSR-PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响兴安落叶松ISSR-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板5个组分的浓度进行了U16(45)和U12 (35)两轮优化,建立了适合于兴安落叶松的ISSR-PCR反应体系.该优化的20μL反应体系包含MgCl2 3.0 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、引物0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶1.0U、模板20ng/20μL.并进一步进行梯度退火试验,找到了最适的兴安落叶松ISSR退火温度为56.5℃.利用所确立的体系对部分兴安落叶松种质进行扩增的结果清晰可靠,多态性好.     

光皮树ISSR-PCR扩增条件和反应体系优化

以光皮树基因组DNA为材料,采用单因素实验,测试了退火温度、模板用量、dNTP浓度、Taq酶用量、Primer浓度、Buffer用量和Mg^2＋浓度等因素对ISSR-PCR的影响。优化的反应体系和条件：总体系为25μL,引物0．2μmol／L、模板20ng、Mg^2＋ 2．5mmol／L、Taq酶0．5U、dNTP为0.1mmol／L和Buffer为2.5μL。扩增程序：94℃预变性5min,1个循环;94℃变性50s,52℃退火1min,72℃延伸1．5min,40个循环;72℃后延伸10min,1个循环。该体系的建立为今后利用ISSR进一步研究光皮树遗传连锁图谱构建、遗传多样性、种质资源鉴定和基因定位奠定了技术基础。     

李ISSR反应体系的优化

以李品种杏梅(hybrid)和斯顿莱(Prunus domestica)为试材，研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对李ISSR扩增结果的影响。结果表明：在20μl的反应体系中，模板DNA含量对扩增结果影响不大，在10—80ng均能得到较好的扩增；椰用量对扩增无明显影响；而Primer、Mg^2 的最适浓度分别为0．25μmol／L、0.25mmol/L；Taq酶在0．5～1．0U均能得到好的扩增条带；退火温度在50-52．1℃范围内均能得到清晰的条带。     

麻竹RAPD反应条件的优化

以麻竹DNA为模板,对影响麻竹RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立麻竹RAPD反应的最适体系。最终得出的麻竹RAPD反应体系为:20μL反应体系,2μL10倍反应缓冲液,模板含量为50ng,2 5mmol·L-1的Mg2+,1 5U的Taq酶,dNTP为1 75mmol·L-1,引物浓度为0 4μmol·L-1。优化后的RAPD反应程序为:94℃3min→[94℃1min→37 5℃1min→72℃1min20sec]40个循环→72℃8min→4℃保持。     

我省板栗主载品种（无性系）RAPD反应体系的建立

在RAPD反应中，有许多影响结果的稳定性和准确性。本项研究采用浙江省8个板栗主载品种（无性系，）对RAPD各种反应进行了探索，结果表明，板栗理想的反应体系为：20μl反应体积含有100mmol/L Tris-HCl,500mmol/LKCl,20mmol/LMgCL2,0.01%Gelatin,dATP、dTTP、dGTP的量各为100μmol/L，50－200ng引物，0．75－1．0单位Taq酶，2－10ng模板NDA。反应条件为：94℃预变性2min，再94℃30s、40℃30s、72℃1．5min扩增37个循环；最后在72℃延伸7min。应用上述反应体系进行板栗PAPD反应，扩增产物在1．0％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后在紫外灯下观察照相，可获得满意的DNA指纹图谱。     

万寿菊RAPD分子标记优化体系的建立

以雄性不育和可育万寿菊及其子代为材料,在PE-2400型PCR仪上进行扩增,通过3次正交试验设计,优化得到了最佳的RAPD反应体系,确定了各个因素的最佳水平。在20 μL反应体系中,最佳的浓度配比为:10×Buffer中含10．00 mmol·L-1Tris-HCl、50．00 mmol·L-KCl、0．001％gelatin、dNTP0．25 mmol· L-1、TaqDNA聚合酶1．5 U、MgCl2 1．25 mmol·L-1、DNA20-60 ng、引物0．60 pmol·μL-1,预变性时间5 min, 退火温度37℃较好,1 min的延伸时间也满足了2 kb以下的DNA片段合成,循环35次能得到较好的 RAPD图谱。     

杉木 SRAP-PCR 反应体系优化与建立

采用L16（45）正交实验设计,对杉木SRAP-PCR反应体系中Mg^2＋、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适宜杉木的最佳SRAP-PCR反应体系。杉木的SRAP-PCR最佳反应体系为：反应体系总体积为25μL,含2.0 mmol／L Mg^2＋、0.3 mmol／L dNTPs 、0.3μmol／L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶、50 ng模板DNA及1×PCR buffer。各因素对杉木基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大, Mg^2＋浓度的影响最小。运用杉木单株基因组DNA对优化SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的杉木SRAP-PCR反应体系稳定可靠。     

云南松SSR—PCR反应体系的优化研究

本项研究以云南松实生苗幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计,分析云南松SSR—PCR扩增反应体系中各组分对扩增结果的影响,并进一步采用正交试验设计对SSR—PCR扩增反应程序进行优化。结果表明,在15μL SSR-PCR反应体系中包括,1×TaqPCRBuffer,模板DNA用量30ng,Taq聚合酶用量1．0U,0．2mmol L-1dNTPs,3．0mmol·L-1Mg2＋以及正、反引物各0．2μmol．L-1;扩增反应程序为,94℃预变性4min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸45s,35个循环;最后72％延伸10min,4℃保存。该反应条件的建立为开展云南松种质资源SSR分子标记研究提供了参考依据。     

麻疯树ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以2年生的麻疯树嫩叶提取的DNA作为模板,固定ISSR-PCR扩增程序,对影响PCR扩增的模板DNA、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶以及Mg^2＋浓度等5因素（不同水平）进行单因素设计优化,得到适合于麻疯树ISSR-PCR扩增的体系为：25μL反应体系中,含模板DNA300 ng、dNTP 0.15 mmol/L、引物0.20μmol/L、TaqDNA聚合酶1.0 U及Mg^2＋3.0 mmol/L。     

红锥ISSR—PCR扩增体系的优化

对广西红锥种群的DNA进行提取和ISSR—PCR扩增体系进行优化。分析了退火温度、模板DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量对反应结果的影响。红锥ISSR—PCR分析较适宜的扩增体系是：25μL PCR反应体积中，buffer（10mM Tris-HCl，pH9．0，50mM KCl，0．1...     

桢楠DNA提取和RAPD条件的优化

以桢楠（Phoebe zhennan）新鲜叶片、硅胶干燥叶片为材料,研究了DNA的提取方法,并对影响RAPD反应的各因素进行了优化。得到了桢楠RAPD的优化反应体系及程序,适合桢楠RAPD反应的体系总体积为25μL,DNA模板2μL,Taq DNA聚合酶用量0.3μL,引物用量1μL,Mg2＋用量5μL,dNTPs用量0.5μL,ddH2O16.2μL;适合桢楠RAPD扩增的程序是94℃预变性3 min,94℃变性1min,36℃复性1 min,72℃延伸2 min,42个循环,最后72℃延伸10 min,产物于4℃保存,同时结果表明硅胶保存的样品完全可以与传统的新鲜叶片得到同样的PCR扩增结果,完全可以满足研究需要。     

赤松外生菌根ITS-PCR体系的建立及优化

以CTAB法提取的赤松外生菌根DNA为模板,应用单因子试验及L16（4^5）正交试验,系统的分析了DNA模板、Mg^2＋、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了赤松外生菌根rDNA ITS扩增反应的优化体系,最优反应体系为：20μL体系中,1×PCR buffer 2μL、DNA模板30 ng、Mg^2＋2.0 mmol/L、dNTPs0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq酶0.5 U。     

川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR优化体系建立及比较

以川山茶品种"茶睡莲"为试验材料,以改良CTAB法提取高质量DNA,采用正交设计L16(45),探讨了Mg~(2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对川山茶ISSR-PCR和SSR-PCR反应体系的影响。建立了相关优化体系:20μL的ISSR-PCR扩增体系中含20 ng模板DNA,2μL10×Buffer,2 mmol/L Mg~(2+),0.15 mmol/L dNTPs,0.6μmol/L引物和1 U TaqDNA聚合酶,扩增退火温度为55℃,35个循环;20μL的SSR-PCR扩增体系中含50 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg~(2+),0.05 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L引物和0.5 U TaqDNA聚合酶,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为38。应用该优化体系,分别用27个川山茶品种DNA进行了ISSR-PCR扩增和SSR-PCR扩增,结果显示,建立的优化体系具有较高稳定性。     

胡桃楸SRAP-PCR体系的优化及建立指纹图谱

首次将SRAP技术应用于胡桃楸的研究中,建立起胡桃楸的SRAP-PCR的反应体系;实验中对影响扩增的5个主要因素进行了优化,确定20μL的反应体系中:模板DNA50ng,Buffer1Mg2+1·25mmol/L,dNTPs0·1mmol/L,Taq酶1·5U,引物0·25umol/L,最佳退火温度为49℃;利用优化后的反应体系成功构建胡桃楸指纹图谱。     

也门铁ISSR-PCR反应体系的优化及应用

运用单因素试验法对影响也门铁ISSR-PCR扩增的各个因素进行了优化,优化体系为:25μL反应体系中,Taq酶浓度0.04 U.μL-1、dNTPs浓度0.18 mmol.L-1、引物浓度0.4μmol.L-1、Mg2+浓度2.0mmol.L-1、模板浓度0.8 ng.μL-1、甲酰胺浓度1.6%、1×buffer,最后用dd H2O补足到25μL。利用优化体系和筛选的引物对也门铁及其嵌合体品种进行了ISSR扩增分析。     

松口蘑SRAP反应体系的优化

以松口蘑为材料,建立了松口蘑SRAP反应的优化体系。即在20μL反应体积中,模板DNA 10ng,引物浓度0．3μmol／L,dNTP 250mmol／L,MgCl 22．5mmol／L,Taq DNA聚合酶0．5U,1×Buffer;反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,共5个循环;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环：72℃延伸5min。     

香榧RAPD分析实验条件的优化

试验通过系统的比较研究 ,建立了香榧 RAPD分析的优化反应体系和实验条件 ,即 2 0μl的反应体系中含有 5 0 ng DNAtemplate、1.5μl 10× Buffer、1U Tag NDA聚合酶、2 .4mmol/L Mg Cl2 、2 40μmol/L d NTPs、0 .8μmol/L Primer。适宜的扩增程序为95℃变性 3 min,1个循环 ;94℃变性 3 0 s,3 6℃退火 3 0 s,72℃延伸 60 s,3 5个循环 ;72℃延伸 5 min,反应终止。该反应体系重复性高 ,条带亮度均匀 ,弥散现象少     

兴安落叶松SSR反应体系的建立与优化

采用L16(4^5)正交试验设计,对影响兴安落叶松SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、d NTPs、Mg^2+、Taq聚合酶浓度及引物浓度)进行了试验分析,其结果表明:兴安落叶松SSR-PCR体积为20μL的最佳反应体系是模板DNA用量50 ng、正反向引物浓度均为5μmol·L^-1、d NTPs浓度为2.5 mmol·L^-1、Mg^2+的浓度为2.5 mmol·L^-1、Taq聚合酶用量为1.0 U、最佳退火温度为60℃。试验所建立的反应体系可进一步用于兴安落叶松SSR遗传图谱构建、多样性分析、良种选育等方面的研究中。