CRISPR/Cas9基因编辑技术在果树作物中的应用研究进展北大核心CSCD

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已成为一种有价值的基因组编辑工具,能够在特定选择的位点改变DNA序列,可以在作物基因组的靶点位置精确地实现删除、替换或插入特定序列,引入理想的目标性状。该工具具有简单、高效、成本低以及功能强大等特性,在柑橘、葡萄、香蕉和草莓等果树中已实现多种类型的应用,包含产生白化表型、调控童期和花期、调控果实品质以及创造矮化和抗病虫害品种等。综述了CRISPR/Cas9系统及其作用过程,介绍了新开发的精准编辑技术,包括单碱基编辑器、引导编辑及CRISPR/Cpf1多基因编辑系统,并详细阐述了CRISPR/Cas9系统在果树基因组编辑中的应用进展,包括果树种类、目标基因及目标性状等,归纳了CRISPR/Cas9系统实现高效编辑所遇到的遗传转化和再生体系、脱靶效应和启动子选择问题,最后提出了不断优化遗传转化和再生体系、合理选择靶位点和设计sgRNA、植物内源启动子及新编辑技术的解决策略。     

利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状

大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统的结构类型及CRISPR/Cas9系统作用机理,介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状,并针对Cas9和sgRNA的表达、遗传转化策略、靶位点选择等影响编辑效率的关键问题进行了分析讨论,旨在为该技术在大型真菌研究中的应用提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。     

基于CRISPR/Cas9技术研究金针菇冷诱导结实基因HK1和HK2的编辑转化系统

对金针菇(Flammulina velutipes)冷诱导相关的组氨酸激酶基因HK1和HK2构建了基因组编辑(CRISPR/Cas9)pgfvs-Cas9-HK1-gRNA和pgfvs-Cas9-HK2-gRNA表达载体,探索了金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度,利用PEG介导的方法将表达载体pgfvs-Cas9-HK1/HK2-gRNA转化金针菇原生质体,经潮霉素筛选后的拟转化子再进行PCR鉴定。结果显示:金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度均为50μg/mL;经潮霉素筛选后的部分拟转化子成功扩增出Cas9的部分片段,携带有HK1、HK2基因载体的Cas9蛋白基因成功整合到了金针菇的基因组中,两个表达载体转化率分别为24.1%和12.5%。     

利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点

西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。     

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。     

CRISPR/Cas9系统在园林植物中的研究展望

CRISPR/Cas9系统是近年来迅速发展起来的一种新型基因编辑技术,作为一种高效的育种研究技术已在多种植物中实现了定点突变,具有广阔的应用前景。园林植物观赏性状的改良对丰富园林景观具有重要的作用,但是园林植物的遗传背景复杂,严重制约了基因编辑技术的应用。该文介绍了CRISPR/Cas9系统的基本原理及在植物中的研究进展,总结了CRISPR/Cas9系统针对不同类型植物适合的筛选方法及目前存在的问题,并展望了该技术在园林植物育种中的发展前景,以期能够高效利用CRISPR/Cas9系统改良无基因组参考的植物,快速获得观赏价值高的新品种。     

梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3∶GUS转入'茄梨'愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proDAM3∶GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型.结果 表明,共有4个转基因株系在靶...     

研究人员将用基因编辑技术唤醒番茄的辣味基因

来自巴西和爱尔兰的研究人员称,他们正在使用CRISPR/Cas9基因编辑技术制造辣味番茄,这些番茄可以用来制作辣椒喷雾、麻醉剂和减肥药等。巴西维索萨联邦大学的阿古斯丁·泽斯哥恩和他的团队在近期出版的《植物科学趋势》中表示,像CRISPR/Cas9这样的基因编辑技术可以“唤醒”番茄中休眠的辣味基因。他们在努力进行制造辣味番茄的工作,希望在2019年年底之前有一些好消息。     

金针菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从金针菇（Flammulina velutipes）7个菌株中筛选出1株高产植酸酶菌株.根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以金针菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约790bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为788bp,采用Blast软件进行序列比对发现,该片段与平田头菇（Agrocybe pediades）的植酸酶基因phy（GenBankAccession：CAC48160）编码的氨基酸具有64%的序列同源性.该片段含有2个内含子,含有植酸酶基因的活性位点高度保守序列（Active-site sequence）-RHGXRXPT.     

Genetic transformation of Prunus domestica L. using the hpt gene coding for hygromycin resistance as the selectable marker

The study and development of transformation technology with new selection schemes is important for various fundamental studies and for crop trait improvement via genetic engineering. Here we have shown that hygromycin resistance is an effective system for plum genetic transformation. Embryonic axes of mature seeds were co-cultivated with Agrobacterium strain LBA4404 containing the pC1381 plasmid carrying the hygromycin phosphotranferase gene (hpt) and β-glucuronidase (GUS) gene or with strain EHA105 containing the plasmid pC1301 carrying the same marker and reporter genes. The latter strain containing a pC2301 plasmid carrying the neomycin phosphotransferase gene (nptII) gene was used as a control. Infected explants were placed on shoot induction medium containing either 5 mg L⁻¹ hygromycin or 75 mg L⁻¹ kanamycin for selection. Green shoots developed from the explants under hygromycin pressure. These shoots showed continued and vigorous growth and development upon transfer onto fresh hygromycin medium. PCR using hpt sequence primers, and Southern blot analysis using a probe from the hpt gene, confirmed the presence of the transgenes and their stable integration in regenerated plants. Full transgenic plants were obtained in a greenhouse. Hygromycin selection was very effective and no escapes were observed. The study demonstrated that hygromycin resistance can be used as an effective selectable marker for plum transformation. The new system developed here is important and useful for multiple gene transformation in plum.     

Expression of hepatitis B virus core gene in Pichia pastoris

AIM: To study the expression of hepatitis B virus core gene in Pichia pastoris and to obtain high-level expressed recombinant HBcAg with good immunoreactivity and high specificity. METHODS: HBV core gene was amplified by PCR from plasmid pHBV1 which contained HBV whole DNA sequence. The PCR product was cloned into pGEM-T vector by TA cloning strategy. After confirmed by DNA sequence analysis, the gene of interest was inserted into the yeast expression vector pPIC9. The recombinant plasmid pPIC9-cAg was constructed and transformed into GS115 by electroporation. The recombinant yeast GS115 was induced by 0.5% methanol. The expressed product was analysed by SDS-PAGE,Western blot and ELISA. RESULTS: The restriction analysis and DNA sequence analysis proved that HBV core gene had already been cloned to yeast expression plasmid pPIC9. The expressed HBcAg existed in SDS-PAGE. Good immunoreactivity and high specificity of the recombinant HBcAg have been proved by ELISA and Western blot. The titre of the recombinant HBcAg in the cell lysate was 1∶12 800. CONCLUSION: The recombinant plasmid pPIC9-cAg was successfully constructed. The recombinant HBcAg with good immunoreactivity and high specificity was successfully expressed in Pichia pastoris expression system and can be applied to further developing HBcAb immunoassay.     

金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆及表达分析

PCR扩增了金针菇(Flammulina velutipes)异戊烯基焦磷酸异构酶基因(FvIDI)的DNA全长和开放阅读框序列.该基因的ORF全长753 bp,DNA全长923 bp,含有3个内含子和4个外显子,编码250个氨基酸,金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶相对分子质量为28450,等电点为5.05.采用实时荧光定量PCR技术研究FvIDI基因在不同发育时期和不同温度下的表达量,结果显示,FvIDI基因在采收期菌盖中表达量最高,4℃诱导处理2～4 h和37℃诱导处理2～6 h的表达量明显高于常规温度21℃处理.     

八氢番茄红素合成酶(PSY2)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

类胡萝卜素合成酶基因LycB导入番茄的研究

以4个番茄品种的子叶为受体,以LycB为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对番茄进行了遗传转化,经愈伤诱导、芽诱导、生根培养和潮霉素选择培养,获得的抗性植株经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因LycB已整合到番茄的基因组中。     

HBsAg/截短型HCV核心蛋白融合基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化

探索乙肝病毒表面抗原/截短型HCV核心蛋白融合基因在植物中表达乙肝丙肝双价抗原的可能性.以期为进一步研制植物乙肝丙肝双价口服疫苗打下基础。利用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在丙肝病毒(HCV)截短型核心蛋白序列的5′端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成-融合基因BC,测序结果正确。将融合基因BC克降到植物表达载体pBin438上,获得pBin438BC,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,采用叶盘法转化番茄。获得了15株抗卡那霉素的番茄植株。对抗性植株进行PCR及Southern检测,8株获得阳性信号,表明目的基因已整合到了番茄基因组中。提取阳性植株的总蛋白.经透析后.将适当浓度蛋白质点在PVDF膜上,用Dot-ELISA方法验证番茄中表达蛋白的活性。结果表明,转基因番茄中有重组蛋白的表达。     

银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定

利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。     

At2基因双T-DNA植物表达载体的构建

以甜瓜品种‘MR-1’为试材,采用PCR技术,扩增出了At2基因并在两端添加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。结果表明:在NCBI上进行BLAST显示其氨基酸序列与GeneBank中已公布的At2基因的同源性为99%;经DNAMAN软件分析,核苷酸序列同源性为99.43%。将其连接在中间表达载体G-pPTN133上,得到替换了GUS基因的中间载体A-pPTN133。A-pPTN133再经ScaⅠ酶切后,插入到经ScaⅠ酶切的pPTN133~-中,构建成双T-DNA植物表达载体At2-pPTN133。经酶切和PCR鉴定证明了所构建载体的正确性。     

金针菇转运蛋白基因fv-mfs1的序列与表达分析

通过分析金针菇(Flammulina velutipes)子实体原基期、伸长期、成熟期的转录组数据,得到一个差异表达基因fv-msf1。对其结构、序列特征及表达情况进行分析,结果显示该基因全长2709 bp,包含13个外显子,12个内含子,开放阅读框长1770 bp,编码589个氨基酸。结构域分析表明该基因编码的蛋白含主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily,MFS)保守结构域。通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative fluorescence PCR,q-PCR)对子实体不同发育阶段以及菌盖不同发育时期的表达量进行分析,结果显示该基因在金针菇伸长期的菌盖(尤其是0.3~0.9cm)中高表达,由此推断该基因在金针菇菌盖发育中发挥一定作用。