金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆及表达分析

PCR扩增了金针菇(Flammulina velutipes)异戊烯基焦磷酸异构酶基因(FvIDI)的DNA全长和开放阅读框序列.该基因的ORF全长753 bp,DNA全长923 bp,含有3个内含子和4个外显子,编码250个氨基酸,金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶相对分子质量为28450,等电点为5.05.采用实时荧光定量PCR技术研究FvIDI基因在不同发育时期和不同温度下的表达量,结果显示,FvIDI基因在采收期菌盖中表达量最高,4℃诱导处理2～4 h和37℃诱导处理2～6 h的表达量明显高于常规温度21℃处理.     

淀粉酶家族基因在金针菇子实体不同发育时期的表达与分析

为分析淀粉酶对金针菇(Flammulina velutipes)子实体发育的作用,针对已经鉴定的金针菇淀粉酶家族基因(6个α-淀粉酶和1个γ-淀粉酶),采用定量PCR方法对其在不同发育时期(从原基形成第1天到第12天成熟开伞期)、不同组织部位(菌盖和菌柄)的表达量进行测定,进而分析其表达模式。结果显示:7个淀粉酶基因在菌柄中表达量均高于菌盖;其中,α-Amy-5和γ-Amy-1在菌柄中的表达量变化为先下调再上调,两个基因预测编码蛋白均有信号肽,亚细胞定位在细胞外,推测其可能参与菌柄细胞壁的形态建成;α-Amy-3亚细胞定位在线粒体中,与其它各发育时期相比,其在菌柄快速伸长期表达量达到最高。α-Amy-1和α-Amy-6基因则在金针菇成熟期表达量最高,推测其可能与金针菇菌盖的发育有关。     

金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因的鉴定与表达分析

以金针菇基因组与转录组数据为基础,通过本地BLAST方法鉴定金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因,命名为GENE5116,并对其结构、编码蛋白的基本性质与表达模式进行了分析,以期了解其在金针菇子实体生长发育过程中的作用。结果表明:该基因有9个外显子,8个内含子,基因总长为1998 bp,共编码438个氨基酸残基,相对分子质量为48987.36,等电点8.83;系统进化分析结果表明该基因与真菌E3泛素连接酶具有高度同源性,与陶兰柱担菌(Cylindrobasidium torrendii)亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明该基因在菌柄的表达量最高且菌柄上部基因表达量显著高于下部,在菌丝的表达量最低,所以推测该基因可能与子实体菌柄伸长有关。     

金针菇寡肽转运蛋白编码基因fvopt1与fvopt2的鉴定与表达分析

基于金针菇(Flammulina velutipes)的基因组和转录组数据,通过本地BLAST方法,获得2个寡肽转运蛋白编码基因,命名为fvopt1和fvopt2,并对其结构、编码蛋白的基本性质、系统进化与表达模式进行分析。结果表明:fvopt1和fvopt2分别含有13和18个外显子,编码蛋白FVOPT1与FVOPT2各含774和772个氨基酸,相对分子质量为86120.25与86192.24,等电点为7.46与7.92,且均无信号肽。保守结构域分析与系统进化分析结果表明,FVOPT1与FVOPT2为寡肽转运蛋白家族成员。实时荧光定量PCR结果表明:在菌丝阶段,fvopt1在无氮培养基中的表达量高于其在含氮培养基中的表达量;在含氮培养基中,fvopt1在整个子实体发育阶段(原基、菌柄和菌盖)中表达量上调,fvopt2只在原基中高表达,推测fvopt1和fvopt2可能与子实体和原基的发育有关。     

金针菇小G蛋白Ran的序列特征与表达分析

基于金针菇(Flammulina velutipes)基因组和转录组数据,运用本地BLAST方法,找到一个小G蛋白Ran的编码基因,命名为FvRan1。运用生物信息学方法进行分析,结果显示:该基因全长为1337bp,编码区长度为1079bp,包含7个外显子和6个内含子,其中4个内含子(I1、I2、I3、I6)在mRNA加工过程中存在可变剪切现象。通过氨基酸序列同源比对和系统发育分析发现,FvRan1具有5个G-Box保守结构域和2个效应器开关,与担子菌中Moniliophthora roreri以及Trametes versicolor的亲缘关系最近。采用RT-qPCR研究FvRan1在不同生长时期及部位、伸长期菌柄的不同部位以及竖直、微重力(旋转)、水平3个不同处理条件下的表达量,结果表明,FvRan1在成熟期菌柄中的表达量最高;在金针菇伸长区段的表达量显著高于生长点和非伸长区段;在模拟微重力条件下,FvRan1呈显著上调表达。FvRan1基因在金针菇菌柄伸长与重力应答过程中可能具有正调控作用。     

广叶绣球菌溶血素基因的序列分析及表达动态

通过转录组测序获得了一个广叶绣球菌(Sparassis latifolia)编码的溶血素基因(latifolysin),进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析溶血素基因表达水平,采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)标记结合二维液相色谱串联质谱鉴定分析溶血素表达差异.结果表明latifolysin基因全长为399 bp,编码133个氨基酸.保守功能域搜索显示latifolysin具有与杨树菇溶血素(aegerolysins)蛋白家族相同的结构域和功能位点,两者序列相似性40％.杨树菇溶血素家族蛋白在真菌中呈不连续性分布.系统进化树结果显示绣球菌溶血素隶属于担子菌类群,与草菇(Volvariellavolvacea)遗传关系较近.实时定量PCR和蛋白定量结果表明,latifolysin和绣球菌溶血素在广叶绣球菌幼菇期表达量最高,且显著高于菌丝体中表达水平.     

三褶虾脊兰CtARF57和CtIAA12基因克隆及功能分析

以三褶虾脊兰(Calanthe triplicata)不同发育时期的花瓣距为试材，基于转录组测序数据，通过克隆获得生长素信号转导途径中CtARF57和CtIAA12基因全长序列，并进行生物信息学分析，探究园林花卉三褶虾脊兰生长素相关响应因子(ARF和Aux/IAA)的表达特性及功能，以期揭示三褶虾脊兰花瓣距的发育机理。结果表明：cDNA全长为3 054 bp和1 124 bp,分别编码911、177个氨基酸。2个基因氨基酸序列与铁皮石斛同源基因的相似性较高，均超过84%。保守结构域分析表明CtARF57蛋白具有B3结构域、Auxin＿resp结构域和Aux/IAA结构域；CtIAA12具有Aux/IAA蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ特异性结构域。实时荧光定量PCR结果显示，其转录水平受到生长素的诱导，不同时期基因表达水平差异明显，2个基因均在三褶虾脊兰花瓣距发育最后一个时期表达量最高，前2个时期表达量较低，与转录组FPKM值趋势一致。综上所述，初步推测2个响应因子基因参与生长素信号传导途径并调控园林花卉三褶虾脊兰花瓣距的形态建成和生长代谢过程。     

广叶绣球菌DASH型隐花色素同源基因Slcry1的序列与表达分析

用关键词"DNA photolyase (pfam 00875)"和"FAD binding domain of DNA photolyase (pfam03441)"搜索广叶绣球菌(Sparassis latifolia)闽绣1号菌株基因组,找到一个候选基因——隐花色素同源基因Slcry1,PCR扩增得到该同源基因cDNA全长1755 bp,基因组全长为2279 bp;利用PROTPARAM预测SlCRY1蛋白含有584个氨基酸,相对分子质量为65800,等电点为8.94;利用SMART和Pfam预测其保守结构域,发现SlCRY1蛋白(584个氨基酸)包含一个DNA光解酶(DNA Photolyase)结构域和一个FAD结合(FAD binding)结构域;用MEGA7软件中的邻位相连法构建系统发育树,发现SlCRY1属于光解酶/隐花色素蛋白家族中的DASH(Drosophila,Arabidopsis,Synechocystis,and Homo species)型隐花色素;最后用荧光定量PCR检测该同源基因在广叶绣球菌不同发育阶段及光照处理下的表达量:在约300 lx白色LED光照下,基因Slcry1表达量随光照时间延长而增加;不同发育时期,Slcry1基因的表达水平为子实体原基菌丝。实验结果揭示:SlCRY1属于DASH型隐花色素,其表达量受到光照的诱导,且随广叶绣球菌的生长发育而上升。     

金针菇类扩张蛋白fvexpl2鉴定及其表达模式分析

基于金针菇基因组与转录组数据,利用在线软件BLAST鉴定了一个扩张蛋白类似物编码基因,命名为fvexpl2,并对其基因结构进行了鉴定,通过构建进化树的方法分析了fvexpl2与担子菌、子囊菌扩张蛋白类似物以及植物扩张蛋白之间的亲缘关系。结果表明:扩张蛋白类似物外显子的数目为4个,内含子的数目为3个,并且CDS的长度是438 bp,分子量为15 746.88 Da,等电点为4.93;进化树图显示fvexpl2与担子菌类扩张蛋白处于同一亚支,亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果则表明fvexpl2在菌柄伸长部位具有较高的表达水平,其表达水平远远高于菌盖、原基以及菌丝部位的表达水平,且其在伸长较快部位表达水平显著高于伸长较慢部位表达水平,所以fvexpl2可能对菌柄伸长起重要作用。     

草菇漆酶基因在子实体形成过程中的表达分析

为了探明草菇(Volvariella volvacea)漆酶基因的功能，采用实时荧光定量PCR方法对11个漆酶编码基因(lac1-11)在子实体不同发育阶段的表达水平进行研究，结果表明：草菇漆酶在针头期、纽扣期、蛋形期、伸长期和成熟期均发生转录；表达趋势分为三类：lac1、lac5、lac7和lac8表达量针头期最高；lac3、lac6和 lac11从针头期至蛋形期逐渐升高，自伸长期表达量有明显下降；lac2、lac4、lac9和 lac10在纽扣期最高，随后表达量逐渐降低，其中lac9与lac10在成熟期又有了小幅度的提高。这些结果说明草菇不同的漆酶在子实体发育中可能起到不同的作用。     

‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因DkADH1的克隆及表达分析

以‘南通小方柿’果实为材料,采用同源克隆的方法,获得了柿乙醇脱氢酶基因DkADH1,其全长为1 377 bp,开放阅读框为1 137个核苷酸,编码379个氨基酸,具有ADH基因典型的结构域和功能域,与番茄、苹果等双子叶植物亲缘性较近。以‘南通小方柿’不同组织为材料,采用qRT-PCR方法对DkADH1及单宁生物合成途径中的相关基因的表达进行分析,同时测定了不同时期果实的单宁含量,结果表明在果实发育过程中,可溶性单宁含量逐渐降低,而不溶性单宁含量不断升高;DkADH1基因在茎、叶、花、果实等器官中均有表达,在果皮中表达量最高。随着果实的成熟,DkADH1表达量总体呈上升趋势。柿果实中单宁合成途径中的相关基因DkF3′5′H和DkMYB4随着乙醇处理果实时间的延长表达量呈下降趋势,推测‘南通小方柿’DkADH1能够抑制单宁合成相关基因的表达,从而降低果实可溶性单宁含量。     

金针菇菌株的酯酶同工酶分析

本文应用垂直平板聚丙烯酰胺不连续电泳,对金针菇(Flammulina velutipes)12个栽培菌株的菌丝体和其中9个菌株的子实体进行酯酶同工酶比较;并对金针菇子实体发育不同时期和不同部位酯酶同工酶的变化进行分析.结果表明,金针菇菌株间酯酶同工酶谱变化较大,且在子实体阶段比菌丝体阶段表现更为明显;同一菌株在于实体不同发育时期和不同部位酶带数量稳定,但显色强弱有明显的变化.子实体伸长期和成熟阶段的菌盖部位酶带显色最深.     

金针菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从金针菇（Flammulina velutipes）7个菌株中筛选出1株高产植酸酶菌株.根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以金针菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约790bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为788bp,采用Blast软件进行序列比对发现,该片段与平田头菇（Agrocybe pediades）的植酸酶基因phy（GenBankAccession：CAC48160）编码的氨基酸具有64%的序列同源性.该片段含有2个内含子,含有植酸酶基因的活性位点高度保守序列（Active-site sequence）-RHGXRXPT.     

香蕉中一个新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及采后表达分析

利用抑制消减文库从香蕉中分离到一个cDNA片断,结合RACE技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1 285个碱基,通过Blastx同源性分析结果显示它与香蕉的一个S-adenosyl-L-methionine synthase(SAMS)基因(GenBank序列号为AF004317)具有82%的碱基同源性,编码的氨基酸顺序有93%同源性,但在cDNA的5’和3’非编码区同源性较低。设计特异引物对此基因进行RT-PCR分析表明,正常成熟的香蕉果实,采后当天表达量较高,随后略有降低,至采后12 d又达到一个相对较高值后迅速下降;高锰酸钾处理的果实,整个成熟期该基因均表现一个比较高的表达量;乙烯利处理的果实,采后表达量明显下降且处在一个比较稳定的水平。     

猴头菌不同生长发育期粗蛋白、粗多糖含量及水溶性粗多糖体外免疫活性

测定猴头菌(Hericium erinaceus)华中猴头菌株不同生长发育期子实体中的粗蛋白、粗多糖和水溶性粗多糖中β-葡聚糖含量,并研究不同生长发育期子实体粗多糖体外刺激巨噬细胞产生NO的活性变化规律.结果表明,供试菌株不同生长发育期子实体的粗蛋白、粗多糖和β-葡聚糖含量以及粗多糖体外刺激巨噬细胞产生NO的活性均存在显著或极显著差异,随着生长发育的进行,猴头菌子实体中粗蛋白含量总体上呈下降的趋势(小菌剌期比前一时期有所增加),而多糖含量则总体呈上升趋势(小菌刺期比后一时期高),β-葡聚糖含量呈先快速上升后平稳的趋势;分裂期粗多糖在浓度500 μg/mL时对RAW264.7释放NO的促进作用较强.