用小RNA深度测序鉴定广西冬种马铃薯病毒

【目的】对广西冬种马铃薯病毒进行鉴定,为无病毒种薯选择和大田防治提供依据。【方法】2012年在马铃薯主要产区采集具有明显病毒病症状的样品,在血清学ELISA检测的基础上,进一步用小RNA深度测序对按症状分类的样品进行混合样本的病毒种类鉴定,再用RT-PCR方法对分组混合样本进行验证。【结果】在109个样本中检测到马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）、马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、马铃薯H病毒（Potato virus H,PVH）、马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）、马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）,同时发现PVS有丰富的株系分化。【结论】近年广西冬种马铃薯病毒种类增多,病症多样,亟需加强种薯管理,培育无毒健康种薯。     

应用RT-PCR技术检测宁夏地区马铃薯脱毒试管苗病毒报告

为进一步推动宁夏马铃薯种薯产业健康、稳定和可持续发展,了解宁夏地区马铃薯脱毒试管苗带有病毒残留的基本情况,本研究对宁夏银北和银南地区11个主要的马铃薯脱毒试管苗品种利用RT-PCR技术分别了检测PVX、PVY、PVS和PLRV4种常见病毒。检测结果显示:宁夏银北和银南地区马铃薯脱毒试管苗主要品种均不带有PVX、PVY、PLRV病毒,但是银北和银南地区的庄薯3号均带有带有PVS病毒。     

黑龙江省马铃薯新病毒株系调查研究

2009年通过对黑龙江省20余个县市马铃薯主产区的马铃薯病叶采集,经鉴别寄主反应、血清学测试、电镜观察、新病毒检测技术等,较全面地了解了黑龙江省马铃薯病毒（包括病毒株系）存在和分布情况。系统鉴定出马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）、马铃薯Y病毒（Ptato virus Y,PVY）、马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）、马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaic virus,CMV）、烟草花叶病毒（Tobacoo mosaic virus,TMV）、烟草脆裂病毒（Tobacoo rattlevirus,TRV）和马铃薯Y病毒坏死株系（PVYn）。TRV,PVYn为局部分布。研究证实至2009年黑龙江省无马铃薯黄矮病毒（Potato yellow dwarf virus,PYOD）、马铃薯V病毒（Potato virus V,PVV）、马铃薯帚顶病毒（Potato mop top virus,PMTV）和安第斯马铃薯潜隐病毒（Andean potato latentvirus,APLV）、安第斯马铃薯斑驳病毒（Andean potato mottlevirus,APMV）的分布,没有发现侵染马铃薯的番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）和苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus,AMV）。检测到马铃薯番茄黑环斑病毒（Potato black ringspot virus,PBRSV）、马铃薯烟草花叶病毒黄斑株系和马铃薯PVYNTN病毒皆呈零星分布。     

我国马铃薯主产区病毒病发生情况调查

为了解我国马铃薯病毒病发生情况,在马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、云南等马铃薯田采集了具有典型病毒病症状的样品、疑似样品和随机无症样品,试管苗和原原种为随机样品,共649份。应用DASELISA方法筛查6种马铃薯主要病毒:PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。结果表明:129份样品为阳性,PVY的检出率最高,为9.86%,PVS次之,为6.47%;试管苗PVS检出最多,为32份,原原种PVX检出最多,为10份,大田样品PVY病毒发生比例最高,为54份;有38份样品是由多种病毒复合侵染造成的,大田PVY+PVS复合侵染率最高,为2.93%,PVS+PVY+PLRV次之,为0.98%,试管苗PVS+PVM复合侵染率最高,为4.85%。通过历年的检测结果比较,试管苗中PVS病毒检出率最高,原原种中PVX和PLRV病毒成为危害最为严重的病害,大田样品中PVY检出率一直居高不下。     

反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。     

黑龙江省马铃薯病毒病的普查及鉴定

通过对黑龙江省近30个县市马铃薯主产地的系统调查采样,经鉴别寄主反应、血清学测试、电镜观察、种薯传毒试验,系统鉴定出马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Ptato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)、马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacoo mosaic virus,TMV)、烟草脆裂病毒(Tobacoo rattle virus,TRV)、马铃薯Y病毒坏死株系(PVYn);标样K-04和番茄黑环病毒(Toma-to black ring virus,TBRV)有强烈的阳性反应,球形粒体,直径约30 nm,但在田间表现蕨叶症状,可认为该标样疑似番茄黑环病毒引起,或可能携带番茄黑环病毒。TRV,PVYn为局部分布,马铃薯蕨叶病呈局部零星发生。经研究证实至2005年黑龙江省无马铃薯黄矮病毒(Potato yellow dwarf virus,PYOD)马铃薯帚顶病毒(Potato mop top virus,PMTV)、安第斯马铃薯潜隐病毒(Andean potato latent virus,APLV)、安第斯马铃薯斑驳病毒(Andean potato mottlevirus,APMV)、马铃薯V病毒(Potato virus V,PVV)、马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)的分布,没有发现侵染马铃薯的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)。     

马铃薯3种病毒的多重PCR检测方法构建

[目的]构建马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）3种马铃薯主要易受感染的病毒多重PRC（multiplex PCR）检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX（Potato virus X）、PVM（Potato virus M）、PVS（Potato virus S）、PVV（Potato virus V）,CMV（Cucumber mosaic virus）等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限：PVA为100 copies/2μl,PVY为100 copies/2μl,TMV为1 000 copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]该研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

马铃薯三种病毒的多重PCR检测方法构建(英文)

[目的]构建马铃薯A病毒(Potato virusA,PVA)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virusY,PVY)3种马铃薯主要易受感染的病毒的多重PRC(multiplex PCR)检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX(Potato virus X)、PVM(Potato virus M)、PVS(Potato virus S)、PVV(Potato virus V),CMV(Cucumber mosaic virus)等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限:PVA为100落copies/2μl,PVY为100copies/2μl,TMV为1000copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

榆林市马铃薯茎尖脱毒培养探究

榆林是我国马铃薯五大优生区之一。马铃薯病毒可直接导致其种性退化、产量和质量大幅度降低。.马铃薯脱毒主要是通过茎尖分生组织培养脱去马铃薯PVS、PVY、PVS、PLRV和PSTV等病毒、类病毒。茎尖分生组织脱毒培养的技术要点有培养基的配置、块茎的选择、钝化和催芽处理、.茎尖剥离、接种,培育出脱毒马铃薯试管苗假植到网室,缓苗后进行移栽用于大田生产。通过科学化管理,可生产出脱毒种署用于推广,这样可以提高优良品种特性,提高种薯产量和质量,有效延长马铃薯品种服务生产的年限。     

中国马铃薯主要病毒病发生情况调查与分析

马铃薯病毒病是造成马铃薯减产的主要因素,为了解中国马铃薯种薯质量及生产中病毒病发生情况,在马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、河北等地采集具有典型病毒病症状的样品、疑似病毒样品和随机无症样品,包括试管苗样品248个,原原种样品93个,大田种薯样品621个,共计962个。应用DAS-ELISA方法检测6种马铃薯主要病毒:PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA。结果表明,219份样品病毒检测结果呈阳性,PVS检出率最高,PVY次之。有10个样品是由多种病毒复合侵染造成。不同级别种薯质量情况为试管苗PVS病毒发生较多,原原种质量较好,大田种薯PVY病毒发生比例最高。     

彩色马铃薯茎尖培养及病毒检测技术

为了探明彩色马铃薯茎尖培养方法,获得彩色马铃薯无毒试管苗,研究了不同质量浓度植物生长调节剂组合的培养基对21份彩色马铃薯后代品系组培苗形成的影响,并用RT-PCR方法对试管苗进行马铃薯主要病毒检测。结果表明,筛选出的组合(MS+NAA0.05mg·L~(-1)+6-BA0.1mg·L~(-1)+GA30.2mg·L~(-1)+泛酸钙0.2mg·L~(-1))可作为闽薯1号茎尖诱导分化的最佳培养基,优化的植物生长调节剂组合在不同的彩色品种茎尖分化和植株形成差异较大,试管苗经RT-PCR检测6种马铃薯病毒(PVX、PVY、PVS、PVA、PVM和PSTVd),获得了11份彩色马铃薯脱毒苗,可用于大田生产用试管苗。     

我国部分马铃薯产区主要病毒病发生情况调查

为探明我国马铃薯产区主要病毒病的发生情况,采用RT-PCR技术对我国9个省、市16个马铃薯种植区的田间马铃薯病毒病发生情况进行了调查.结果表明:马铃薯Y病毒(PVY)检出率最高,达到94％,其次是马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯A病毒(PVA),检出率分别为50％、44％.其中PVA在贵州省、PVS在河南省和吉林省的发生尚属首次报道.病毒复合侵染情况普遍,复合侵染率达81.3％.另外,对我国部分地区脱毒试管苗和脱毒种薯的带毒情况进行检测,结果表明:在脱毒试管苗中4种病毒均有检出,其中PVS检出率最高(22.2％),其次为马铃薯卷叶病毒(PLRV)、PVY和PVA,但在脱毒种薯中未检出病毒.我国马铃薯田间病毒病发生普遍,且多为复合感染.     

乌鲁木齐马铃薯病毒病种类及防治措施

我国马铃薯生产田中主要病毒为PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA和PVM。本试验选取乌鲁木齐地区马铃薯脱毒试管苗、原原种、各级良种共86个样品,应用酶联免疫吸附试验（DAS-ELISA）方法对6种病毒进行检测,分析乌鲁木齐地区脱毒马铃薯各级种薯病毒携带情况,以便更好地了解本地脱毒马铃薯种薯质量。为有针对性地防治马铃薯病毒病提供理论依据。     

费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗的培养基筛选与病毒的RT-PCR检测

以分别携带3种病毒(PVX、PVY、PLRV)和纺锤块茎类病毒(PSTVd)的费乌瑞它(Favorita)马铃薯(Solanum tuberosum)无菌苗为材料,38℃、4h热处理4周,剥离带1个叶原基的茎尖,接种至不同浓度激素组合的24种MS固体培养基上,24℃、16h培养15d后统计茎尖的愈伤组织诱导率和分化成苗率;反转录PCR(RT-PCR)检测茎尖分化再生苗的脱毒率.结果表明,最适宜费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗的培养基为MS+0.075 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA +0.10 mg/L GA3,愈伤组织诱导率为75％,分化成苗率为47.5％;再生苗3种病毒PVX、PVY和HRV的脱毒率分别为65％、90％和100％,纺锤块茎类病毒PSTVd的脱毒率为10％.     

马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的RT-PCR检测

以感染PSTVd的马铃薯试管苗及块茎和健康的试管苗及块茎为材料，应用韩国INTRON生物化学制药公司生产的PSTVd检测试剂盒提取试管苗及块茎这2种不同材料的mRNA，以此为模板，进行cDNA合成及PCR扩增，从感病组织扩增到一段长度为360bp的特异PCR扩增产物，而健康试管苗无此扩增产物。试剂法可对马铃薯不同材料进行PSTVd检测，60分钟内即可分离出mRNA，整个诊断时间为4h，方法简便、快捷、灵敏度高，可作为马铃薯种薯生产早期PSTVd诊断及引进品种的快速、有效检测手段。     

马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立

依据马铃薯病毒PVS、PVX、PLRV、PVA的CP保守序列设计特异性引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物,建立了能够同步检测PVS、PVX、PLRV、PVA的RT-PCR多重检测体系。该方法对PVS、PVX、PLRV、PVA扩增出的靶带大小分别为435、625、222、300 bp,凝胶电泳易辨别区分。研究结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、快速简便,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

双重RT-PCR法快速检测多种马铃薯病毒的研究

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。     

马铃薯主产区病毒病发生情况调查

为明确马铃薯病毒病的发生特点,对中国10个马铃薯主产区进行病毒病发生情况调查。随机抽取马铃薯脱毒试管苗、原原种、大田种薯样品共1 330个,应用血清学DAS-ELISA方法对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA 6种病毒进行实验室检测。初步分析了马铃薯各级种薯病毒病的发生情况,并与2004~2006年病毒病的发生情况进行了比较分析。     

马铃薯试管苗病毒检测技术研究

根据大兴安岭马铃薯种薯生产实际,应用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测茎尖组织培养试管苗的带毒情况,鉴定危害马铃薯生产的6种主要病毒(PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV),并结合指示植物如千日红进行最后鉴定,筛选健康、无毒的试管苗,为切段扩繁及试管薯生产作准备。该方法简单易操作,可作为国内生产脱毒种薯单位的标准检测方法进行推广。