羊种布氏杆菌3型Omp25基因序列及其表达蛋白生物信息学分析

为进一步研究外膜蛋白Omp25的结构和功能,以羊种布氏杆菌3型青海省海晏县自然株为研究对象,通过基因的克隆测序,采用生物信息学方法对外膜蛋白Omp25基因及其编码的氨基酸序列的理化性质、分子结构、分子表面可能性、柔韧性、亲水性、抗原指数、B细胞抗原表位进行了详细分析。结果显示:羊种布氏杆菌3型Omp25分子一级结构的氨基酸序列的各项参数存在5段共同区段,其中59~74、93~112、182~202位氨基酸的各项生物信息学参数尤为突出,是其B细胞表位优势区的可能性很大。     

Omp22与牛布鲁氏菌感染后的巨噬细胞蛋白互作研究

为了探讨牛布鲁氏菌544A株感染巨噬细胞的c DNA文库中筛选与Omp22相互作用的蛋白,对布鲁氏菌的致病机理进行研究。将布鲁氏菌细胞膜可分为3组:第1组为94 k Da的外膜蛋白,第2组为41~43 k Da外膜蛋白,第3组为22~31 k Da的外膜蛋白。第1组外膜蛋白只是外膜蛋白的一小部分;第2组外膜蛋白是布鲁氏菌细胞外膜孔道蛋白;第3组外膜蛋白是由两种相关的22 k Da蛋白和31 k Da蛋白组成,31 k Da蛋白已经被证实了是一类细胞外膜孔道蛋白,而22 k Da蛋白(Omp22)的功能还不是很清楚。酵母双杂交技术是一种常用的而且有效地研究蛋白-蛋白相互作用的方法,已经广泛的应用到蛋白研究领域。本实验采用Cyto Tra P酵母双杂交系统,以Omp22为诱饵,从牛布鲁氏菌544A株感染巨噬细胞的c DNA文库中筛选与Omp22相互作用的蛋白,对布鲁氏菌的致病机理进行阐述,探索Omp22在布鲁氏菌致病中的作用。     

C型产气荚膜梭菌β毒素蛋白结构及抗原表位预测

利用DNASTAR、I-Tasser软件对C型产气荚膜梭菌β毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析.综合β毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,B细胞抗原表位可能位于肽链2~4、7~16、23~26、36~40、55~58、72~75、172~179、190~193、196~203、211~214、246~249位氨基酸区域;结合三级结构预测结果显示,190~193、211~214成为表位的可能性较大.     

尼罗罗非鱼DMRT蛋白B细胞表位的预测

[目的]预测尼罗罗非鱼DMRT蛋白B细胞表位。[方法]以尼罗罗非鱼Dmrt基因序列为基础,按Garnier-Robson法,Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测其编码蛋白的二级结构;用Kyte-Doolittle法,Emini法及Jameso-Wolf法分别预测B细胞表位。[结果]Garnier-Robson法和Chou-Fasman法的预测结果均表明,在尼罗罗非鱼DMRT蛋白分子N端第31~56、68~75、110~116、209~211区段和第239~243区段可能是α螺旋中心;蛋白N端第95~99、177~183、225~234区段和第251~254区段可能是β折叠中心;按Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对DMRT蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测DMRT蛋白的B细胞表位,DMRT蛋白N端第13~16、35~38、47~54,84~93、101~109、127~156、166~177区段和第198~201区段附近很可能为B细胞表位优势区域。[结论]该研究结果为DMRT蛋白克隆抗体的制备及探索尼罗罗非鱼性别调控机理提供了参考资料。     

4株新城疫病毒F蛋白和HN蛋白的计算机模建与表面抗原分析

选取新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)广东分离毒GM株(强毒株)和JM株(弱毒株)以及疫苗毒La-Sota株和标准强毒F48E9株,对其融合蛋白(F)和神经氨酸酶(HN)的编码基因序列进行分析,并利用Insight II软件包(Version 2000)进行F蛋白和HN蛋白C端蛋白单体的空间结构模建.结果显示,4个NDV毒株F蛋白单体分子的空间结构极为相似,大致分为3部分,即头部、茎部和柄部.其中头部结构主要由一些折叠股组成,茎部和柄部主要由螺旋结构组成.比较各毒株F蛋白表面蛋白溶剂可及表面积(ASA)后发现,该蛋白有5个线性B细胞表位和8个比较保守的抗原决定簇位点,蛋白头部残基的空间位置随毒株的不同而变异较大.GM株与F48E9株存在36个氨基酸残基的差异,JM株和LaSota株存在20个氨基酸残基的差异.研究结果还表明,4个NDV毒株的HN蛋白C端空间结构较保守,由多个折叠股和4段螺旋结构组成,其抗原决定簇位点也高度保守,只有4个氨基酸残基存在差异.     

羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105株OPM25和OPM31蛋白B细胞抗原表位分析

应用PCR技术对羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105株的OMP25和OMP31基因进行扩增、克隆和测序。测序结果显示,NN1202和LA1105株的OMP25和OMP31基因在布鲁氏菌种间高度保守。应用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域;应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数。对各方法的结果综合分析,OMP25蛋白的27~34、59~65、69~75、101~107、148~154、182~189、197~202区域以及OMP31蛋白的25~32、50~58、63~70、102~111、125~130、166~173、176~183区域可能是优势B细胞抗原表位。     

猪型布鲁氏菌omp31基因的原核表达与亲和纯化

以猪型布鲁氏菌基因组作为模板进行基因序列的扩增,利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达,来研究外膜蛋白基因omp31的序列特性与重组表达情况。结果表明：猪型布鲁氏菌omp31基因的开放阅读框序列全长为723 bp,编码240个氨基酸。通过大肠杆菌原核表达,成功表达出了目标重组蛋白,利用GST\|tag亲和柱进行蛋白质纯化,重组蛋白分子量与预期的553 kD相一致。     

DEV核衣壳蛋白二级结构与B细胞表位预测

为预测和分析鸭肠炎病毒NP蛋白的二级结构和B细胞表位,以DEV-NP基因推导的氨基酸序列为基础。采用Chou-Fasman法、Ganmier-Robson法和Karplus-Schulz法预测该蛋白二级结构;按Kyte—Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测其B细胞抗原表位。结果表明,DEV-NP蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的转角、无规则卷曲等柔性区域以及α-螺旋与β-折叠区段,且在蛋白肽链中有多个区段可形成B细胞抗原表位,其中第10—15和182—186区段及其附近可能是DEV-NP蛋白的B细胞表位优势区。     

牦牛生长激素基因分子特性分析

设计特异性引物,利用RT-PCR方法从牦牛脑垂体中扩增出生长激素基因(YGH)编码区全序列,并进行分子特性分析.结果表明:牦牛生长激素基因编码区全长654 bp,包含一个完整的阅读框,编码217个氨基酸.采用生物信息学方法对分子特性进行分析表明:动物生长激素基因在进化上非常保守,牦牛生长激素基因氨基酸序列与黄牛、山羊、绵羊、马、猪、猫和犬的同源性分别为100%、99.1%、98.6%、88.9%8、8.5%、88.9%和89.4%.牦牛生长激素蛋白有2个明显的疏水区域,存在2个强跨膜区和信号肽,是一种分泌型蛋白质,二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,三级结构包含第28-215位氨基酸残基;牦牛生长激素蛋白有较高的抗原指数和抗原表位,这与YGH编码蛋白具有良好的抗原性相一致.     

致病性坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了扩增坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列和了解该蛋白的分子特征,以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板,利用染色体步移技术分别扩增已知序列的5'端旁侧序列和3'端旁侧序列,并测序和拼接,对拼接结果进行生物信息学分析。结果显示,成功获得F.necrophorum血凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列,全长4247bp,含有1个3372bp的开放阅读框,编码1123个氨基酸,蛋白质分子质量约为120ku。生物信息学分析表明,该蛋白没有明显的信号肽序列和跨膜结构;该蛋白质第750位~1123位氨基酸残基区域具有较强的抗原性;SMART预测显示,该蛋白存在一个自转运蛋白结构域、血凝活性结构域和多个参与碳水化合物代谢的结构域。上述结果提示,成功获得F.necrophorum血凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列,编码约为120ku的蛋白质,该蛋白质可能是具有血凝活性的外膜自转运蛋白家族的成员,并且该蛋白质的C端可能具有较强的抗原性。     

Role of a highly conserved bacterial protein in outer membrane protein assembly

After transport across the cytoplasmic membrane, bacterial outer membrane proteins are assembled into the outer membrane. Meningococcal Omp85 is a highly conserved protein in Gram-negative bacteria, and its homolog Toc75 is a component of the chloroplast protein-import machinery. Omp85 appeared to be essential for viability, and unassembled forms of various outer membrane proteins accumulated upon Omp85 depletion. Immunofluorescence microscopy revealed decreased surface exposure of outer membrane proteins, which was particularly apparent at the cell-division planes. Thus, Omp85 is likely to play a role in outer membrane protein assembly.     

羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。     

鲤春病毒血症病毒Shlj1株糖蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测

为预测鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)Shlj1株糖蛋白(Glycoprotein,G)的空间结构及B细胞抗原表位,采用RT-PCR法从接种SVCV的鲤上皮细胞悬液提取的病毒总RNA中扩增糖蛋白基因,并通过序列测定获得Shlj1株糖蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸序列,利用Phyre2对Shlj1分离株的糖蛋白空间结构进行预测,使用DNAStar软件综合分析糖蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数参数。结果表明:获得的SVCV Shlj1株糖蛋白核苷酸序列长1527 bp,推导出其氨基酸序列为509aa;空间结构预测显示,SVCV Shlj1株糖蛋白存在一定数量的α-螺旋、β-折叠、β-转角及大量无规则卷曲结构,空间构象较规则;抗原指数及抗原表位指数分析显示,糖蛋白中存在许多抗原指数较高的区域,该区域平均抗原指数为1.025,最大值达1.250,其中5个区域(4~26、145~157、293~302、315~327、407~491氨基酸区段)可能是B细胞抗原表位的主要分布区域。本研究结果为SVCV糖蛋白表位疫苗的设计及单克隆抗体的制备奠定了理论基础。     

Polypeptide sequences essential for RNA recognition by an enzyme

Many RNAs are complex, globular molecules formed from elements of secondary and tertiary structure analogous to those found in proteins. Little is known about recognition of RNAs by proteins. In the case of transfer RNAs (tRNAs), considerable evidence suggests that elements dispersed in both the one- and three-dimensional structure are important for recognition by aminoacyl tRNA synthetases. Fragments of alanine tRNA synthetase were created by in vitro manipulations of the cloned alaS gene and examined for their interaction with alanine-specific tRNA. Sequences essential for recognition were located near the middle of the polypeptide, juxtaposed to the carboxyl-terminal side of the domain for aminoacyl adenylate synthesis. The most essential part of the tRNA interaction strength and specificity was dependent on a sequence of fewer than 100 amino acids. Within this sequence, and in the context of the proper conformation, a segment of no more than 17 amino acids was responsible for 25% or more of the total synthetase-tRNA free energy of association. The results raise the possibility that an important part of specific RNA recognition by an aminoacyl tRNA synthetase involves a polypeptide segment that is short relative to the total size of the protein.     

Visual pigment renewal in the mature frog retina

It has been demonstrated by autoradiography that radioactive amino acids serve as precursors for proteins which are subsequently incorporated into retinal rod outer segment discs in mature animals. By the isolation and purification of visual pigment from retinas of adult frogs after injection of tritiated leucine and phenylalanine, it has been shown that at least part of this labeled protein consists of visual pigment (rhodopsin).     

表达两种不同外膜蛋白的禽大肠杆菌融合菌株的构建

对从陕西省主要养鸡地区病死鸡及鸡胚中分离的致病性禽源大肠杆菌,用SDS-PAGE进行Omp分型。采用不同浓度溶菌酶作用不同时间裂解细胞壁,制备原生质体,在高渗平板上再生培养;在药敏试验的基础上,结合Omp型分析,选择具有交叉耐药且Omp型不同的菌株,利用PEG诱导进行原生质体融合,在含双抗的高渗平板上筛选融合株,对不同代次的融合株分别进行革兰氏染色镜检、生化鉴定、血清型鉴定和Omp型分析。结果表明,所构建的融合菌株染色镜检和生化特性均符合大肠杆菌特征,75%融合子可凝集2亲本的O抗原,25%凝集其中1个亲本的O抗原;外膜蛋白型表现为1个或2个亲本的带型,但都有不同程度的增强。经稳定性检验证明其为遗传学上稳定的融合子。     

A hydrophobic transmembrane segment at the carboxyl terminus of thy-1

The mode of integration of the glycoprotein thy-1 within the cell membrane has been controversial due to an apparent lack of a transmembrane hydrophobic segment. Rat and mouse complementary DNA and genomic clones encoding the thy-1 molecule have been isolated and sequenced. These studies have enabled us to determine the intron-exon organization of the thy-1 gene. Furthermore, they have revealed the existence of a sequence which would encode an extra segment (31 amino acids) at the carboxyl terminus of the thy-1 molecule. These extra amino acids include a 20-amino acid hydrophobic segment which may be responsible for integration of thy-1 within the plasma membrane.     

3个血清型鸡源大肠杆菌1型菌毛蛋白抗原位点变异分析

采用Goldkey及DNA Star分析软件对发表的3个不同血清型的鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)进行同源性及抗原位点分析。结果显示,3种鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))l型菌毛pilA基因相似性为91.36％～98.38％,所编码的氨基酸同源性为93.50％～97.84％;3种血清型鸡大肠杆菌(O_1、O_(78)及O_(88))1型菌毛蛋白二级结构在1～73位及150～185位氨基酸的二级结构基本相似,而111～150位氨基酸的α螺旋与β折叠的数量有所不同。菌毛蛋白亲水性、抗原性及抗原决定簇预测表明,来源于3种血清型大肠杆菌的1型菌毛蛋白在l～110位及150～184位氨基酸存在相似的二级结构及抗原位点,且不同血清型之间存在一定的共同抗原。     

犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析

根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。