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根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5''端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。 相似文献
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比较猪瘟病毒E2基因的真核表达质粒proVAX-E2n和pVP22-E2n体外表达效率以及体内的免疫效果,以从中选出高效的猪瘟病毒核酸疫苗.将上述表达载体转染Hela细胞进行体外表达后,用RT-PCR和间接ELISA法检测Hela细胞体内和体外表达产物;免疫6~8周龄昆明白小鼠, 用间接ELISA法和MTS法检测小鼠血清中CSFV特异性IgG抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能.结果表明2种E2重组质粒均能在Hela细胞中正确表达,且proVAX-E2n的E2蛋白表达量(OD值为0.575 4)明显高于pVP22-E2n(OD值为0.306 05)(P〈0.05);proVAX-E2n刺激机体产生的抗体水平(最高抗体滴度为1:2 200)显著高于pVP22-E2n免疫组(最高抗体滴度1:1 600);淋巴细胞增殖结果显示proVAX-E2n(刺激指数4.073)与pVP22-E2n(刺激指数2.205)相比,能诱发小鼠产生更强的CSFV的特异性淋巴细胞增殖反应.本研究表明proVAX真核表达载体对E2基因体外表达效率和小鼠免疫效果均高于pVP22真核表达载体. 相似文献
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利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。 相似文献
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为了研究牛病毒性腹泻病毒N~(pro)蛋白的催化切割效率,首先扩增GSTZ毒株的N~(pro)基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)上,使其在表达菌E.coli BL21 (DE 3)中表达,确定正确的N~(pro)基因碱基序列,然后构建含有切割位点的pET-28a-N~(pro)-GFP重组融合质粒,在原核表达系统中研究N~(pro)蛋白的切割效率。结果显示,GSTZ毒株的N~(pro)蛋白成功地在原核表达系统中表达,重组融合蛋白质N~(pro)-GFP在原核表达系统中的切割效率约为60.28%。 相似文献
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为分析非洲猪瘟病毒O174L基因,通过同源重组方式将O174L基因连接至p RK5M-C-2×Strep载体,构建重组质粒,经PCR扩增和测序鉴定正确后,将重组质粒转染至猪小肠上皮细胞系(porcine intestinal columnar epithelial cells,IPEC-J2)中,通过免疫荧光和Western blot检测O174L蛋白的表达情况。PCR及测序结果显示,p RK5M-C-2×Strep-O174L重组质粒构建成功。免疫荧光和Western blot检测结果显示,O174L蛋白能够在IPEC-J2细胞中稳定表达。生物信息学分析结果显示,基于O174L基因和B646L(p72)基因序列构建各分离毒株的2个系统发育树间排列高度相似。来自中国的16株分离株中,O174L基因序列的相似性高达96.76%~100.00%。其中,与中国爆发的其他Ⅱ型分离株相比,China/2018/Anhui XCGQ在O174L蛋白的第67、75及110位氨基酸存在差异,GZ201801在第110位氨基酸存在差异。Ⅰ型分离株SD/DY-I/2021和HeN/ZZ-P1/2021的O... 相似文献
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克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体. 相似文献
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利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移栽体pFastBacHT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白. 相似文献
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猪瘟病毒石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达 总被引:1,自引:1,他引:1
【目的】对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达,以期获得可溶性表达产物,为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于pMAL-p2X载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21-CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中,共得到16株重组表达菌,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。【结果】E2基因的4个主要抗原结构域均可在这4种表达菌中表达,但以BL21-CodonPlus(DE3)-RP的表达效果最好,可表达出可溶性并且产量较高的目的蛋白。免疫印迹结果表明,表达的目的蛋白可以被猪瘟阳性血清和针对E2蛋白的单克隆抗体所识别。【结论】只表达目的基因的抗原结构域,可以缩短表达片段的长度,有利于获得可溶性目的蛋白,并且具有良好的血清学反应的特异性。 相似文献
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猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾 总被引:19,自引:2,他引:19
猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的猪都没有副作用,并且有良好的免疫效力,它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护,但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释,建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统,初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能,并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗,赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除,借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施,有关国家有效地控制了猪瘟,甚至消灭了猪瘟。尽管如此,要在全球范围内根除猪瘟,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。 相似文献
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猪瘟病毒石门株E2基因序列分析 总被引:6,自引:0,他引:6
经非猪瘟免疫猪增殖猪瘟病毒石门株,从抗凝血中直接提取病毒RNA进行RT-PCR,获得了猪瘟病毒石门株E2基因片段。克隆后测序,结果表明石门株的E2囊膜糖蛋白与国外报道的5株猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白具有相同的骨架结构,即均具有15个半胱氨酸残基和5个潜在糖基化位点,此外石门株也具有保守序列RYLASLH。同源性比较表明,石门株与日本的ALD株和GPE#+-株同源性最高,而与欧洲的Alfort株同源性最低。与国内的疫苗种毒(482代)、疫苗毒以及国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株同源性比较表明,石门株与种毒(482代)同源性最高,其次为国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株,而与国内使用的疫苗毒同源性最低。本研究提示国内疫苗毒的E2基因在生产中有较大变异,可能导致抗原漂移。 相似文献
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猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究 总被引:11,自引:0,他引:11
王琴 《中国农业科技导报》2006,8(5):13-18
猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的高度致死性、接触性传染病,严重危害全球养猪业的重要传染病,也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。近年流行态势十分复杂,本文就CSF的流行情况、病原致病特征及综合防治技术研究等方面进行全面概述,井为猪瘟的防制提出具体实施方案。 相似文献
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利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白. 相似文献
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利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。 相似文献
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猪瘟脾淋苗阻断带毒母猪垂直传播的效果 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]观察猪瘟脾淋苗阻断带毒母猪垂直传播的效果。[方法]以3个有代表性的规模化猪场为试验点,将猪瘟带毒母猪随机分成试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和对照组。试验Ⅰ组采用脾淋苗1.5头份免疫,试验Ⅱ组采用脾淋苗2头份免疫,对照组采用细胞苗4头份免疫。采用酶联免疫吸附试验检测带毒母猪所产仔猪的猪瘟抗原状况。[结果]接受猪瘟脾淋苗免疫的带毒母猪所产仔猪的抗原阳性率为18.5%,明显低于对照组母猪所产仔猪的抗原阳性率(48.1%),但试验Ⅰ组与试验Ⅱ组之间的抗原阳性率差异不显著。[结论]猪瘟脾淋苗免疫带毒母猪对阻断垂直传播有很好的效果. 相似文献
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采用RT-PCR技术,利用2对引物,从猪瘟病毒(CSFV)强毒石门株感染的猪血中成功扩增了NS4B基因,片段大小分别为757bp和774bp。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性,与同属的BVDVSD-1株和NADL株也有较高的同源性。 相似文献
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猪瘟病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
以猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)标准强毒石门株为模板,RT-PCR扩增CSFV E2基因N端的主要抗原区(△E2).PCR产物定向克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-AE2,转化Eacterium coli BL21-Codonplus(DE3),IPTG诱导重组△E2蛋白表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达.KCl预染切胶法纯化△E2蛋白,以其为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了CSFV抗体ELISA检测方法.用该方法对331份临床血清进行检测,并与IDEXX公司阻断ELISA试剂盒进行了相符性验证,符合率为74%.为研制猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础. 相似文献