RT-PCR法分离伊氏锥虫VSG基因的研究

应用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离伊氏锥虫安徽株克隆虫体 ShTatl 的二个抗原变异体ShTatl.3和 ShTatl.5总 RNA,在含有甲醛的琼脂凝胶电泳后,转印到硝酯纤维膜上.根据布氏锥虫 VS-Gm RNA3′端保守序列,设计合成了一个互补于它的含18个碱基的寡恢苷酸5′-GGTGTTAAAATA-TATCAG-3′.经~(32)P 标记、Northern 杂交,首次证明伊氏锥虫含有同样的保守序列.利用合成的18碱基寡核苷酸作为反转录特异引物,成功合成 cDNA 第一链,以 cDNA 第一链作为 PCR 扩增模板,均能特异性的扩增出一条主带为1.5kb 的 DNA,与 VSG 基因大小相符.根据所有锥虫 mRNA 在5′端的保守序列,设计合成了 RT-PCR 下游引物5′-GAACAGTTTCTGTACTATATTG-3′.对伊氏锥虫安徽株克降虫体的二个变体 ShTatl.3和 ShTatl.5的 RNA,进行 RT-PCR 扩增,均特异性地分离出 VSG 基因,二个变异体 VSG基因大小差异显著,其中 ShTatl.3的 VSG 基因为1.7kb,而ShTatl.5的 VSG 基因则为1.4kb.     

一株志贺氏菌分离株对肉鸡致病性试验

从感染志贺氏菌的肉鸡肠道黏膜中分离出一株强致病性的志贺氏菌分离株,以健康肉鸡为目标进行致病性研究。使用SS琼脂培养基从感病肉鸡中分离出31株志贺氏菌分离株,按照同一剂量(107 CFU)以灌喂的方式对30日龄肉鸡进行感染,筛选出强致病性分离株。使用强致病性分离株通过不同剂量灌喂30日龄肉鸡,对细菌致病性进行研究。结果:分离得到一株强致病性志贺氏菌分离株BDS8,在以5×10⁸ CFU的量对30日龄肉鸡进行灌喂后,从2h开始出现腹泻直至24h并未恢复,在10-15d内出现死亡,解剖后器官出现严重炎症病变及肠道明显出血。结论:志贺氏菌分离株有较好的致病性,成功感染了健康肉鸡,为后续使用不同方法治疗感染志贺氏菌的肉鸡建立了基础。     

一株牛流行热病毒的分离与鉴定

牛流行热病毒(BFFV)是引发世界范围内牛流行热最主要病原之一,给奶牛业的发展造成严重危害。本研究通过RT-PCR对疑似牛流行热奶牛抗凝血样品进行检测,选取阳性样品颅内接种3日龄乳鼠,7日后乳鼠死亡,鼠脑组织通过PCR扩增出BFFV目的条带,乳鼠颅内重复接种3次,乳鼠发病死亡时间明显提前。选取阳性脑组织接种BHK-21细胞,盲传3代后出现明显细胞病变,特异性引物扩增获得目的条带,测序结果与牛流行热病毒序列一致,表明成功分离到一株牛流行热病毒。     

一株优异螺旋藻的分离及其优化培养

[目的]规模化养殖螺旋藻(Spirulina sp.)联产营养均衡食品、功能保健品和药品已日益发展为一种工农融合的新型产业。培育高产高效优质藻种始终是螺旋藻产业发展的主攻领域。[方法]从规模化螺旋藻养藻池水体分离纯化到一株优异的螺旋藻变异株Sp-SX07。生物量和藻蓝蛋白含量等测定显示,该藻株生物量大、生长速度快、藻蓝蛋白含量丰富。通过对不同光质、光照强度、pH值、温度等培养条件下该藻株生产特性的测试,建立了该藻株优化培养的主要参数。[结果]在LED暖白光(光暗比12h/12h)、光照强度4 000lx、温度25～30℃、起始pH 8.5～9.5之间生长良好,连续培养12d平均日生长量为0.87g·L~(-1),比出发株Sp-SX02高45%。藻蓝蛋白含量达藻粉干重23.69%,比出发株高42%左右。[结论]优异螺旋藻藻株Sp-SX07的鉴定及优化培养参数的建立为该优异藻株商业化生产及富含藻蓝蛋白的功能食品研发提供了科学依据。     

一株碱性果胶酶产生菌的分离与培养条件研究

以果胶为唯一碳源,从蚕沙中分离碱性果胶酶产生菌,为提高家蚕对桑叶果胶成分的消化吸收提供参考。结果表明:从蚕沙中筛选到一株产碱性果胶酶克雷伯氏菌(Klebsiella sp.),菌落灰白色,边缘整齐,16S rDNA序列与Klebsiella sp.SPC06相似性达99%。研究获得菌株培养的最佳碳氮源为葡萄糖和酵母粉,最适生长温度35℃,pH值为8.0,最优培养条件下的生长曲线显示,培养15 h进入对数生长期,35 h后进入稳定生长。钙离子为辅助剂时酶活性最高,达48.50 U·mL~(-1),显示了一定的应用潜力。     

从弗氏链霉菌中筛到的1株泰乐菌素产生菌

以泰乐菌素标准品为对照，采用纸层析法对收集到的１１株弗氏链霉菌的发酵滤液进行鉴别，发现其中０２８菌株的纸层析谱与标准品完全相同。进一步将该菌株经ＮＴＧ诱变后，筛选获得的１株突变株Ｈ１８８，进行摇瓶发酵。并从发酵滤液中分离、提取得到纯品。经紫外分光光度计和高效液相色谱检测表明，它与泰乐菌素标准品属同一物质。从而证明０２８菌株是１株泰乐菌素产生菌。     

从外观有脚弱症的小母鸡中分离出一株新城疫病毒

<正> 在引进牧场22日后的82日龄的鸡群中,发生了脚弱症,使3％的鸡死亡或淘汰。用显微镜观察脑及脊髓,看到病理组织学上的变化极像禽脑脊髓炎(AE),临床症状也类似禽脑脊髓炎。为了分离禽脑脊髓炎病毒,每个脑组织试验材料用0.1ml接种5个6日龄SPF鸡胚的卵黄囊。在接种后第2或第3     

一株牛源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定与药敏试验

为了明确哈密某牛场犊牛死亡的病因,对从病死犊牛肺脏组织中分离到的一株革兰阴性短杆菌,进行了细菌分离纯化、16S rDNA测序鉴定、小鼠致病性试验、药敏试验检测。鉴定该分离菌为肺炎克雷伯氏菌,其16S rDNA扩增序列与GenBank中肺炎克雷伯氏菌同源性达99%。对小鼠致病性强。该菌分离株对硫酸阿米卡星、左氧氟沙星敏感;对阿奇霉素、头孢曲松钠、替米考星注射液和乳酸环丙沙星中度敏感;对氟苯尼考、头孢拉定、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大霉素耐药。     

一株克氏原螯虾病原——霍乱弧菌的分离鉴定

从尾扇边缘溃烂的克氏原螯虾中分离到一株优势菌LK-18,并对该菌株进行种属鉴定和致病性分析。通过菌落形态观察、16S rRNA测序、血清型分析及基因特性鉴定对细菌的类别进行初步判断,并采用浸泡感染、肌肉注射和腹腔注射等方式进行人工感染实验对细菌的致病性进行评估。经16S rRNA测序分析和4个管家基因（atpA、pyrH、recA、gyrB）串联分析,该菌株最终被鉴定并命名为Vibrio cholerae LK-18。V. cholerae LK-18经PCR鉴定不属于O1和O139血清型,但含hly毒力基因和几丁质分解相关的几丁质酶（chitinase,Chi）基因。人工感染实验虽未能重现烂尾症状,但从克氏原螯虾烂尾组织中分离的V. cholerae LK-18具有致病性,能够引起克氏原螯虾的死亡。研究结果表明霍乱弧菌LK-18是一种致病菌,不仅扩大了非O1/O139群霍乱弧菌的感染宿主范围,同时预警霍乱弧菌有导致克氏原螯虾养殖业暴发疾病的可能,因此要提前做好该疾病的预防工作,从而避免霍乱弧菌感染带来的损失。     

一株虾夷扇贝病原——科氏希瓦氏菌的分离鉴定及其致病性

为探究近年来养殖虾夷扇贝Patinopecten yessoensis脓疱病的发病原因,取病灶部位涂布培养,挑取优势单菌落,进行分离纯化、生理生化试验、药敏试验、溶血试验、人工感染试验和组织病理检验等研究。结果表明：从扇贝病灶部位中共分离获得12株优势菌株(YD-1～YD-12),经16S rDNA基因序列比对发现,12株优势菌株与科氏希瓦氏菌Shewanella colwelliana一致性均较高,选取序列一致性最高(99.86%)的分离菌株YD-1进行细菌培养和透射电镜观察发现,该菌株于培养基中呈圆润光滑的乳黄色菌落(直径1.0～1.5 mm),为具有端生鞭毛的杆状菌;菌株YD-1革兰氏染色为阴性;综合生理生化试验和分子生物学试验结果,鉴定分离菌株YD-1为科氏希瓦氏菌;药物敏感性试验显示,菌株YD-1对头孢噻肟、头孢哌酮、氯霉素和阿奇霉素等药物高度敏感;菌株YD-1于28、37℃时出现α溶血性;人工感染试验显示,菌株YD-1对虾夷扇贝具有较高致病性,半数致死浓度(LD₅₀)为2.08×10⁶ CFU/mL;人工感染的扇贝主要表现为外套膜...     

一株从片烟中分离的纤维素酶产生菌B.Pumilus培养条件优化研究

[目的]优化短小芽孢杆菌(B.Pumilus)菌株TX3产纤维素酶条件,为其降解片烟中所含纤维素提供理论依据.[方法]应用单因子试验考察碳源种类、烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度和pH对菌株TX3发酵产纤维素酶的影响,在此基础上选取烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度、pH作为显著因子,采用响应面分析法对此3种显著因子进行优化和分析.[结果]菌株TX3最适产酶条件为发酵初始pH6.93,烟梗粉末添加量1.24％,硫酸铵浓度0.35％,以此条件进行摇瓶发酵72 h,其纤维素酶活力达到9.91 U/ml,比优化前高了31.4％.[结论]烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度、pH对菌株TX3产纤维素酶单个及交互影响均显著.     

伊氏锥虫不同株的表面变异糖蛋白分离、纯化及特性比较

锥虫的抗原变异非常频繁,阻碍了免疫学防治技术的建立,国内外虽然对此有较多研究报告,但对中国不同地理、宿主株伊氏锥虫表面变异糖蛋白(VSG)分离和特性比较尚无报道,而我国北方新疆骆驼株伊氏锥虫和南方牛、马伊氏锥虫存在来源、地理、宿主和生化特性的差异,因此我们对这两个虫株的 VSG 进行了分离、纯化和特性比较研究,所用虫株来源于新疆骆驼体内、安徽水牛体内.分离后克隆为单一虫株,经小白鼠、大白鼠体内繁殖,鼠血经过 DEAE-52纤维素层析获得纯净锥虫,再经超声裂解,经过两次超速     

牛表皮祖细胞的体外分离培养

[目的]探索和建立牛表皮祖细胞体外分离与培养体系。[方法]无菌取3个月龄的胎牛皮肤组织,用组织块法培养获得细胞,用L—DMEM培养基（添加5％FBS,0．05mmol／LCaCl2,20ng／mlEGF,20ng／mlbFGF,1％B-27,0．4斗g／mlhydrocortisone）置细胞培养箱内培养。在显微镜下观察细胞的克隆形成能力,免疫细胞化学染色鉴定a6、B1整合素。[结果]获得的细胞有很高的克隆形成能力,a6、p1整合素免疫细胞化学染色阳性。RT—PCR检测结果表明,P,代时Oct4基因有表达,但传代超过P11代时,Oct4基本不表达。[结论]该研究可为进一步采用组织工程技术构建皮肤组织奠定基础。     

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。     

体外培养伊氏锥虫的可变表面糖蛋白的分离与鉴定

体外培养后分离出的３个伊氏锥虫变异群体，经环磷酰胺处理在鼠（ＣＹ大鼠）扩增收虫。虫体纯化后超声波裂解，超速离心制成了可溶性抗原，经Ｓｅｐｈｄｅｘ Ｇ－５０脱盐和ＤＥ－５２离子交换层析提纯可变表面糖蛋白（ＶＳＧ）。     

从红皮病病猪分离到的一株猪肠道病毒

从红皮病猪分离到一株病毒,在PK15细胞系中盲目传代后能够适应,并产生明显的细胞病变,特征为细胞变圆,折光力强,最后自玻面脱落,病毒也能适应IBRS细胞系。病毒悬液用100,000g超速离心沉淀,沉淀物的负染标本在电镜下观察,看到直径20—30nm的病毒颗粒,呈二十面体对称;在喷涂投影标本中则呈球状。5-碘-2-去氧尿核苷不能抑制其生长,吖啶橙染色看到细胞质内存在红色颗粒。病毒对乙醚不敏感,对pH3.0不敏感,50℃60分钟能将其完全灭活,但1M MgCl_2对它有保护作用。病毒在IBRS传代细胞单层培养中于琼脂复盖层下容易形成空斑,在不用中性红的情况下能清晰可见。根椐病毒的主要特征,可以认为这是一种猪肠道病毒。