猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

猪圆环病毒4型实时荧光RAA检测方法的建立

为快速检测猪圆环病毒4型(PCV4),本研究根据PCV4的Cap基因片段保守区设计引物和探针,建立了PCV4重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RAA),并应用该方法对40份猪组织样品进行检测。结果表明,该方法可在20 min内,42℃恒温条件下特异性检测出PCV4,以猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒核酸为模板进行反应的扩增结果均为阴性;最低检出限至7.42×10¹拷贝/μL,灵敏度较高。利用建立的RAA检测方法和常规PCR法分别对猪组织样本进行检测,均未检出,表明当前猪场流行率较低。综上所述,本研究建立的PCV4实时荧光RAA检测方法快速简便、特异性强、灵敏度较高,可应用于PCV4的临床筛查与流行病学研究。     

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10⁶ ～1.0×10¹ copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10¹ copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法.该方法对7.87×103～7.87×109拷贝/μL的PCV3标准质...     

猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

检测猪圆环病毒2型SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2(开放阅读框2)基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计PCR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。多次试验证明,该方法具有良好的重复性。同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。     

猪圆环病毒2型特异性荧光定量PCR检测方法的建立与应用

研究旨在建立基于SYBR Green I荧光定量PCR检测PCV 2的技术方法.根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV 2)的基因序列(HQ148879),设计一对特异性引物,利用普通PCR技术扩增出PCV 2的ORF2基因702bp片段,并克隆到pVAX1载体,以纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度...     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,分别设计2对引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了2种病毒的双重PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。用105份临床病料对本研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗种毒株的筛选

为筛选满足猪圆环病毒2型灭活疫苗制苗要求的毒株,选择河南省8个地区的8株猪圆环病毒2型分离株进行抗原性分析,将各分离株培养后用不同滴度的病毒原液和其分别稀释至同一滴度(4.233×10⁴拷贝/μL)的病毒液分别制成油佐剂灭活疫苗,免疫小鼠后采血测定其抗体动态水平,以进行免疫效力评价。结果显示,8株圆环病毒2型分离株中8#和12#分离株原液制备的疫苗免疫后诱导产生的抗体水平较高,二免后1周抗体水平即高于1∶800,达到猪圆环病毒2型灭活疫苗的国家质量标准要求,3周时达到高峰,比对照商品疫苗诱导产生的抗体水平更高;其分别稀释130倍和463倍后制备的疫苗诱导产生的抗体水平在二免后3周也能达到1∶800。提示,猪圆环病毒2型8#和12#分离株毒价高,免疫效力良好,是理想的疫苗候选株。本研究丰富了猪圆环病毒2型灭活疫苗毒株的种毒资源,为研制高质量的猪圆环病毒2型疫苗奠定了基础。     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。     

Establishment and Preliminary Application of Nested PCR for the Detection of Porcine Circovirus Type 2

Porcine circovirus type 2 (PCV2) caused significant economic losses of swine industry,it's very important to establish a economy and rapid detection method.To strengthen the prevention and control of porcine circovirus disease,rapid and high sesitive detection method of PCV2 was established using nested PCR.According to PCV2 ORF2 gene conservative region,we designed two pairs of nested PCR primers,constructed ORF2 gene recombinant plasmid for standard template and optimizated the PCR reaction conditions to establish nested PCR detection method of PCV2 and detect the clinical samples of pig farms.Our results showed that the sensitivity and repeatability of this method were very high,the minimum detection level was 10 copies/μL and detection rate of clinical samples was 97.3%.In brief,the established nested PCR detection method of PCV2 in this study provided powerful means for quick and efficient detection of PCV2,and prevention and control of porcine circovirus disease in the swine industry.     

猪圆环病毒2型巢式PCR检测方法的建立与初步应用

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)给养猪业造成了重大的经济损失,建立经济、快速的检测方法尤为重要。本研究旨在利用巢式PCR技术,建立高灵敏度PCV2检测平台,以加强对猪圆环病毒病的防控。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计内、外2对巢式PCR引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式PCR检测方法,并对猪场临床样本进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法灵敏度高、重复性强,最低检出量为10拷贝/μL,检出率达97.3%。本研究建立的巢式PCR检测方法为快速、高效地检测PCV2以及为猪圆环病毒病的防控提供有力手段。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在猪体中的组织分布研究

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在猪体中的组织分布情况,针对PCV3 Cap蛋白基因设计筛选出一对特异性引物和探针,通过对荧光PCR引物、探针浓度进行优化,建立了基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的PCV3检测方法,并应用该方法对人工感染PCV3猪的多种组织器官进行病毒含量检测。结果显示,建立的PCV3实时荧光定量PCR检测方法特异性较好且灵敏度高,可检测低至1 copy/μL的PCV3病毒核酸量,而对其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。PCV3主要存在于肺脏、淋巴结,在扁桃体和脾脏中有少量存在。试验表明,所建立的荧光定量PCR检测方法可用于PCV3的快速定量检测,对PCV3在猪体中的组织分布情况的研究为进一步揭示PCV3的组织嗜性和致病机理提供理论依据。     

荧光定量PCR检测2型猪圆环病毒方法的建立

通过克隆2型猪圆环病毒（PCV2）的开放阅读框2（0RF2）基因编码其核衣壳蛋白（Cap）的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的靶序列设计一对引物和一条TaqMan探针.对PCR反应条件优化后,对构建的标准阳性模板定量,然后1 0＆#215;倍比稀释进行荧光定量PCR（qPCR）扩增并制作标准曲线,初步建立了PCV2检测的qPCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0＆#215;102拷贝/μ L,线性范围为101 ～ 109,达9个数量级,并且具有很好的特异性.对起始浓度为1.0＆#215;108、1.0＆#215; 106、1.0＆#215;104拷贝/μL的标准品的最终实际测得CT均值分别为12.77、19.72和26.89;变异系数分别为0.25％、0.10％和0.13％,均小于1％,说明此方法具有良好的准确性和重复性.     

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本试验旨在为PCV2的快速诊断提供技术手段。用纯化的原核表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(pET-Cap)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株能够稳定分泌抗pET-Cap抗体的杂交瘤细胞株3D5和5C5。经建立的间接ELISA试验检测3D5、5C5细胞上清效价分别为1∶2048、1∶1024;诱生腹水的效价分别为 1∶204800、1∶102400,杂交瘤染色体数目分别为95条、96条。Western blotting结果表明,2株单抗能与病毒发生特异性反应。传代培养20代,3个月内复苏冻存3次,3D5、5C5能够稳定分泌抗体。