东方田鼠皮肤成纤维永生化细胞的建立

为建立东方田鼠皮肤成纤维细胞(MfSF)系,本研究采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的pSV3neo重组质粒导入原代MfSF中,通过G418筛选,阳性克隆扩大培养,建立永生化MfSF系.实验结果表明,阳性细胞克隆在G418筛选第三周后出现,经扩大培养已稳定传代达42代,而且生长状态良好,PCR及RT-PCR检测结果表明,SV40 T基因已整合到MfSF中并稳定表达.本研究利用SV40 T基因导入制备了永生化MfSF细胞系,为动物间成纤维细胞比较研究及相关病原的研究提供了敏感细胞系.     

不同动物原代细胞的永生化方法及其应用

细胞永生化是一项运用多种手段人为地将不同类型的外源性永生化基因导入目的细胞,打破细胞的正常分裂周期并使其具备无限增殖能力的技术,现已被广泛应用于不同动物原代细胞中。为了探究促使细胞永生化的几种常用方法如何介导细胞永生化,不同方法之间的相关因素有何关联和区别,以及这些方法如何应用到不同动物的细胞中,本文通过对几种促使细胞永生化的作用机制、方法及其在不同动物细胞(如猪单核细胞/巨噬细胞系、牛肠上皮细胞系、牦牛瘤胃上皮细胞系、鸡前脂肪细胞系、鸡胚胎成纤维细胞系、鸭肠上皮细胞系、兔黑色素细胞系和斑节虾淋巴细胞系等)中的应用现状进行概述,发现细胞永生化主要涉及端粒与端粒酶激活、病毒基因[如人类疱疹病毒(EBV)、猴空泡病毒40(SV40)和人乳头瘤病毒(HPV)基因]的转染整合,以及运用Cre-LoxP介导的重组系统对细胞进行可回复性永生化等多个方法,且其核心都是对细胞端粒酶活性的调控。此外,不同动物细胞可通过上述多种方法实现永生,但是也有极少部分细胞受其自身性质的影响,只可选择某一特定方法。因此,对不同动物原代细胞永生化方法及其应用进行研究,不仅可为建立具备功能性的永生化细胞系提供理论依据,也...     

稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。     

绵羊不同妊娠时期卵巢转录组差异表达比较分析

[目的]探究随着绵羊体内胎儿的发育,母体卵巢转录组表达水平的变化。[方法]试验绵羊为苏格兰黑面羊和特克赛尔羊F₁代杂交品种,3个妊娠时间分别为妊娠23 d、妊娠35 d和妊娠100 d。从NCBI的高通量测序数据SRA存储库下载3个妊娠时期绵羊卵巢转录组的18个样本数据。使用Z-Score方法对转录组数据进行标准化处理。将妊娠23 d、妊娠35 d的绵羊卵巢组织进行比对,妊娠35 d、妊娠100 d的绵羊卵巢组织进行比对,使用R语言的limma包进行基因差异表达分析,筛选DEGs,以P-Value<0.05和|logFC|≥2作为筛选DEGs条件。利用DAVID在线软件对DEGs进行注释及功能富集分析,并以P-Value<0.05作为信号通路显著富集标志。[结果]在妊娠23 d与妊娠35 d组绵羊卵巢中筛选出54个DEGs,妊娠35 d与妊娠100 d组绵羊卵巢中筛选出68个DEGs,两组均包含HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1基因。妊娠23 d与35 d组绵羊卵巢的54个DEGs显著富集到包括内质网蛋白质加工信号通路、核糖体信号通路、雌激素信号通路、癌症蛋白聚糖信号通路、扩张型心肌病信号通路、肥厚型心肌病信号通路6条通路;妊娠35 d、妊娠100 d组绵羊卵巢的68个DEGs显著富集到包括癌症相关信号通路、黏着斑信号通路、抗原加工与提呈信号通路、细胞外基质受体相互作用信号通路、细菌侵袭上皮细胞信号通路、内质网蛋白质加工信号通路、核糖体信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症蛋白聚糖信号通路和前列腺癌信号通路11条通路。[结论]在妊娠期间雌激素信号通路上的HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1基因表达有很大变化,这些基因可能对绵羊妊娠维持有着重要的作用。     

GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达

试验旨在构建山羊生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）慢病毒载体,并使其在山羊原代成纤维细胞中稳定表达。利用全基因合成法克隆了绵羊GDF9基因的CDS全长片段,长约1 362 bp,编码453个氨基酸。利用双酶切和连接,将GDF9基因片段亚克隆至慢病毒载体中,构建了过表达GDF9的慢病毒载体。将慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞后,获得了滴度为1×10⁶ TU/mL的慢病毒。利用制备的GDF9慢病毒感染山羊原代成纤维细胞后,观察荧光表明,60%以上的细胞能够观察到红色荧光,说明制备的慢病毒对山羊原代成纤维细胞具有较高的感染效率。经过嘌呤霉素筛选后,所有的细胞均能观察到红色荧光。实时荧光定量PCR分析表明,制备的细胞系中GDF9表达水平比对照组高12.17倍,说明成功获得了稳定表达GDF9的山羊成纤维细胞系。本试验结果为进一步研究GDF9基因的生物学功能,以及山羊未来的种质资源创新奠定基础。     

秦川牛CAP2基因CDS区克隆及表达谱分析

[目的]克隆秦川牛CAP2基因的编码区序列（CDS）,分析该基因在不同组织及原代脂肪细胞分化过程中的表达特征。[方法]采用RT-PCR方法扩增秦川牛CAP2基因的CDS区,运用ProtPram、TMpred、ProtFun 2.1 Server等在线网站进行CAP2蛋白的生物信息学分析;通过油红O染色和qPCR检测成脂标志基因PPARγ和FABP4基因的表达水平以构建牛原代脂肪细胞诱导分化体系;利用qPCR检测分析CAP2基因在秦川牛7种组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背脂）和原代脂肪细胞分化过程（0~10 d）中的表达。[结果]秦川牛CAP2基因CDS区长1 461 bp,编码486 个氨基酸,氨基酸序列主要由无规卷曲和α-螺旋构成。CAP2基因在脂肪组织中高表达,极显著（P<0.01）高于其他组织。牛原代脂肪细胞诱导分化过程中,PPARγ和FABP4基因的表达量逐渐上升,与第0天相比第10 天时表达量达到最大（P<0.01）;与对照组相比,诱导分化组脂滴积累明显增加;CAP2基因表达量也随时间推移逐渐上升,以0 d为对照,第10天表达量最高（P<0.001）。[结论]成功克隆了秦川牛CAP2基因全长1 461 bp的编码区;CAP2基因在牛脂肪组织中以较高水平表达,且CAP2基因可能参与脂肪生成与分化过程,预测CAP2基因可能是促进成脂分化的转录因子,对维持牛脂肪细胞状态发挥关键作用,可能作为秦川牛肉质性状的候选基因,该研究结果为进一步揭示牛CAP2基因的功能提供基础资料。     

SV40LT抗原介导的蝙蝠胎儿肾细胞永生化

蝙蝠是许多新发人兽共患病病毒的自然储存宿主,由于缺乏蝙蝠细胞系,只能利用其他哺乳动物细胞系来分离蝙蝠病毒,因此成功分离的几率较低。为建立稳定的蝙蝠细胞系,本研究利用胰酶消化法培养东亚水鼠耳蝠(Myotis petax)的胎儿原代肾细胞。利用重组逆转录病毒转导法将SV40 LT抗原基因转导入蝙蝠胎儿原代肾细胞,经嘌呤霉素筛选获得LT基因整合和表达的阳性细胞,并进行连续传代培养。RT-PCR和western blot检测表明转导的细胞中有SV40 LT基因的整合和表达。转导细胞在软琼脂中培养不能够形成克隆,表明其未发生癌性转化。对第33代的转导细胞进行单细胞克隆,获得了3个衍生的细胞系,其中Mp-Ki03细胞系已培养至第60代。病毒感染试验表明蝙蝠西江病毒和蝙蝠轮状病毒均可以感染该转导细胞系。本研究通过SV40 LT抗原建立了永生化的蝙蝠胎儿肾细胞系,并且该细胞系对蝙蝠病毒易感,对分离与鉴定蝙蝠病毒以及研究病毒感染蝙蝠细胞的机制具有重要的作用。     

永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析

旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免疫荧光法鉴定其角蛋白18(CK18)和人端粒酶逆转录亚基(hTERT)表达情况;RT-PCR检测其hTERT mRNA的表达;采用CCK-8法绘制细胞生长曲线检测其增殖能力;利用流式细胞仪检测其周期和细胞凋亡情况;核型分析检测其倍体情况;从mRNA和蛋白水平检测其谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)和雄激素受体(AR)的表达情况。结果显示,原代绵羊附睾上皮细胞呈典型的铺路石状形态。hTERT成功转入绵羊附睾上皮细胞,传45代后,hTERT-SEECs仍呈铺路石状;hTERT-SEECs仍可稳定表达CK18和hTERT,并且拥有正常的二倍体核型;hTERT-SEECs增殖能力高于原代细胞,hTERT-SEECs处于G1期的细胞比例显著低于SEECs(P0.05),处于S期细胞比例显著高于SEECs(P0.05),且其活细胞率显著高于SEECs(P0.05),凋亡率显著低于SEECs(P0.05); hTERT-SEECs和SEECs的GPX5和AR蛋白表达量差异不显著(P0.05)。本研究所建立的hTERT-SEECs经长期培养后仍具有正常的附睾上皮细胞形态,增殖能力强并保留了附睾上皮细胞的生物学特性。     

绵羊肺炎支原体内蒙古分离株DnaJ基因克隆表达及其免疫原性研究

[目的] 克隆表达绵羊肺炎支原体DnaJ基因,研究其表达产物的免疫原性。[方法] 以绵羊肺炎支原体内蒙古分离株NM03-MO株基因组DNA为模板,克隆其DnaJ基因序列,对蛋白质序列进行分析比对及三维结构预测;将该基因片段连接至pColdⅠ表达载体,构建pColdⅠ-DnaJ原核表达载体表达重组DnaJ蛋白并纯化,通过Western blot技术检测其与支原体抗体阳性血清的结合活性。[结果] NM03-MO株DnaJ蛋白序列与绵羊肺炎支原体序列同源性最高,但三维结构存在一定差异,重组DnaJ蛋白与绵羊肺炎支原体阳性血清有较好的结合活性,初步证明该蛋白具有免疫原性。[结论] 绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白被首次成功克隆表达,且具有较好的免疫原性,为后续分子致病机制研究及新型疫苗研制奠定基础。     

17α-甲基睾酮对稀有鮈鲫精巢DNA甲基转移酶基因表达的影响

[目的] 以稀有鮈鲫雄鱼为研究对象,探讨17α-甲基睾酮（17α-methyltestosterone,MT）对稀有鮈鲫精巢甲基转移酶（DNMT）基因相对表达量的影响。[方法] 采用不同浓度MT（25、50和100 ng/L）处理稀有鮈鲫雄鱼7、14和21 d,处理结束时,每组随机解剖10条鱼,取精巢组织,Trizol一步法提取总RNA,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DNA甲基转移酶基因（dnmts）相对表达量。[结果] MT处理稀有鮈鲫雄鱼7 d,25 ng/L MT处理组（P<0.05）、50 ng/L MT处理组（P<0.01）和100 ng/L MT处理组（P<0.05）精巢dnmt3基因相对表达量显著（或极显著）降低;25 ng/L MT处理组和50 ng/L MT处理组精巢dnmt5基因相对表达量显著（P<0.05）降低;50 ng/L MT处理组精巢dnmt7基因相对表达量显著（P<0.05）降低。MT处理稀有鮈鲫雄鱼14 d,100 ng/L的MT处理组dnmt3、dnmt5、dnmt6、dnmt7基因相对表达量显著（P<0.05）升高;50 ng/L的MT处理组dnmt1基因相对表达量极显著（P<0.01）升高。MT处理稀有鮈鲫雄鱼21 d,50 ng/L MT处理组和100 ng/L MT处理组dnmt1基因相对表达量显著（P<0.05）升高;100 ng/L MT处理组dnmt8基因相对表达量极显著（P<0.01）升高。[结论] MT可以干扰稀有鮈鲫精巢DNA甲基转移酶基因dmmts的mRNA表达。MT对DNMTs酶活性的影响以及是否可以通过改变DNA甲基化水平对稀有鮈鲫精子的发生产生影响有待研究。     

饲喂频率对妊娠母猪背膘厚和繁殖性能的影响

[目的] 研究饲喂频率对妊娠母猪背膘厚和繁殖性能的影响。[方法] 挑选加系杜洛克经产母猪480头,配种时按照胎次（2~7胎）、背膘厚（11~22 mm）相近的原则随机将母猪分为T1组（每天饲喂1次）和T2组（每天饲喂2次）,两组每天等量饲喂。T1组母猪220头,饲喂时间为8：00;T2组母猪260头,饲喂时间为8：00和15：00,每次饲喂量为总量的一半,定位栏饲养。[结果] ①饲喂频率不影响妊娠56 d、开配-妊娠56 d的背膘厚（妊娠56 d背膘厚-开配背膘厚）（P>0.05）;T2组妊娠110 d（P=0.06）、妊娠56-110 d（P=0.09）背膘厚（妊娠110 d背膘厚-妊娠56 d背膘厚）有高于T1组的趋势。②饲喂频率对窝产总仔数、活仔数、死胎数、木乃伊胎数、初生窝重以及初生个体重均无显著（P>0.05）影响。③在三胎母猪中,T2组妊娠110 d（P=0.01）、妊娠56-110 d（P=0.04）背膘厚均显著高于T1组;五胎及以上母猪,T2组妊娠56-110 d（P=0.08）背膘厚有高于T1组的趋势。④饲喂频率不影响二胎母猪窝产总仔数、死胎数、木乃伊胎数、初生窝重以及初生个体重（P>0.05）,但二胎母猪中T2组活仔数有高于T1组的趋势（P=0.07）。[结论] 饲喂频率由每天两餐减少到每天一餐不会对母猪的繁殖性能产生不利影响。     

水杨酸治疗奶牛蹄皮炎效果评价

目的探讨水杨酸治疗奶牛蹄皮炎的效果。方法选取45只蹄皮炎患病奶牛,对其进行随机分组,其中,5只为阴性对照组,不给予治疗措施;20只为抗菌药物对照组,给予林可霉素进行治疗;20只为水杨酸治疗组,给予40%水杨酸软膏。分别于给药第0、3、14、30天对奶牛进行跛行评分与皮肤疼痛评分并记录结果,对治疗效果进行评价。结果在给药第3天时,抗菌药物对照组和水杨酸治疗组都没有出现痊愈的病例,经过治疗后跛行程度明显减轻。给药第14天时,水杨酸治疗组的治愈率为45%,明显高于抗菌药物对照组（25%）;治疗有效率为75%,高于抗菌药物对照组（60%）。给药第30天时,水杨酸治疗组的有效率为65%,高于抗菌药物对照组（55%）。结论水杨酸临床治疗效果较好,可以作为治疗奶牛蹄皮炎的药物使用。     

巴戟天多糖对胫骨软骨发育不良的肉鸡生产性能、胫骨指数、胫骨钙磷灰分和血清电解质的影响

目的旨在探究巴戟天多糖（Morinda officinalis How polysaccharides,MOP）对福美双诱导的胫骨软骨发育不良（tibial dyschondroplasia,TD）肉鸡生产性能、胫骨指数、胫骨钙磷灰分和血清电解质的影响。方法选取1日龄健康AA肉仔鸡120只,随机分为3组,每组4个重复,每个重复10只肉鸡。对照组（CON组）饲喂基础日粮;福美双诱导TD组（TD组）饲喂基础饲料,在第4天到第7天的饲料中添加100 mg/kg的福美双进行TD模型建立;巴戟天多糖组（MOP组）在接受TD造模处理后,在第7天到第15天的饲料中添加400 mg/kg的巴戟天多糖。结果与CON组相比,从试验开始到试验第7天,TD组肉鸡的平均采食量和平均日增重显著（P<0.05）降低,料肉比增加（P>0.05）;在试验第7天、第11天和第15天时,TD组肉鸡的胫骨生长板宽度和生长板宽度系数显著（P<0.05）增加,胫骨重量和胫骨长度显著（P<0.05）降低,胫骨重量指数降低（P>0.05）,胫骨灰分含量显著（P<0.05）降低,并且血清中电解质紊乱;与TD组相比,在试验第11天和第15天时,MOP组肉鸡的料肉比有降低的趋势（P>0.05）,MOP组肉鸡的生长板宽度和生长板宽度系数显著降低（P<0.05）,胫骨重量、胫骨长度和胫骨重量指数均显著（P<0.05）提高;在试验第11天时,MOP组肉鸡的胫骨灰分含量显著（P<0.05）提高;随着试验时间的延长,MOP组肉鸡的血清电解质含量趋于平衡。结论饲料中添加巴戟天多糖可以有效缓解和改善由福美双诱导的肉鸡TD症状。     

转hTERT基因的山羊胎儿成纤维细胞的生物学特性及其表达分析

用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。     

利用脂质体法建立转Toll样受体4基因大尾寒羊胎儿成纤维细胞株的研究

利用脂质体转染法获得转Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)基因的成纤维细胞,将其作为供体细胞,再通过体细胞核移植技术构建重构胚,最终生产出转TLR4基因且性别可控的大尾寒羊。本研究通过原代培养大尾寒羊胎儿皮肤成纤维细胞,并进行SRY基因性别鉴定,利用脂质体转染法转入TLR4基因,然后分别从形态学与分子水平检测TLR4基因的表达,将稳定表达转TLR4的成纤维细胞核移植入绵羊去核卵母细胞中构建重构胚。最终获得5个稳定表达TLR4的阳性细胞克隆,经SRY基因性别鉴定为雌性细胞株,通过实时荧光定量PCR分析,在第4代转染的细胞中TLR4表达量最高,比未转染细胞高出7.4816倍(P<0.01),卵裂的重构胚中有EGFP的表达。试验成功构建出含TLR4基因的重构胚,为今后生产出性别可控的抗病转基因绵羊地方新品种奠定基础。     

Establishment of Fetal Large-tailed Han Sheep Fibroblasts Cell Line Transfected with Lipofectamine 2000 Vector Containing TLR4 Gene

Exploiting the method of liposome transfection to obtain modified Toll-like receptors 4(TLR4) gene fibroblast cells as competent donor, build reconstructed embryos, which finally produced transfected TLR4 gene and gender controllable Large-tailed Han sheep by somatic cell nuclear transfer technology.In this study, through primary culturing the fetus dermal fibroblasts from Large-tailed Han sheep, to identify the SRY gene gender.Using the method of liposome transfection transferred TLR4 gene into fibroblast cells, then detected whether TLR4 gene expression stably or not in morphology level and molecular level respectively, transplanting fibroblast cells which stably expressed TLR4 gene into oocytes without nucleus from Large-tailed Han sheep for building reconstructed embryos.To harvest 5 positive clones by fibroblast cells with stable expression level of TLR4.According to the identification of the SRY gene gender, the cell lines were female.The analysis of Real-time fluorescent quantitative PCR, the fourth generation of transfected cells had the highest expression level of TLR4, which were higher than control group in 7.4816 times (P<0.01).The cleavage reconstructed embryos had stable expression level of EGFP.We succeeded in building reconstructed embryos with TLR4 gene and lay the foundation for producing the disease-resistant and gender controllable transgenic sheep in the future.     

连续重复超数排卵、冲胚对引进品种肉羊快速扩繁的效果研究

[目的] 评价引进品种肉羊的连续重复超数排卵（超排）、冲胚、胚胎移植等繁育技术集成模式的应用效果。[方法] 于2016—2018年,对选取的1 575只澳洲白（n=230）、白头杜泊（n=228）、黑头杜泊（n=541）、白头萨福克（n=200）、黑头萨福克（n=376）5个品种母羊,进行间隔30 d以上的连续同期发情（孕酮海绵栓）与超排（330~450 IU FSH+200~300 IU PMSG+0.1 mg PG）处理;经过腹腔内窥镜输精后进行子宫角冲胚,回收胚胎后计数并评估质量,挑取部分胚胎进行移植;对比分析品种、季节、重复超排次数等对胚胎生产指标的影响。[结果] 共获得18 496枚胚胎,有14 971枚可用胚;胚胎移植后的受胎率为69.8%,产羔率为93.2%;只均总胚数和只均可用胚数2项指标显示,胚胎生产特性以白头萨福克、黑头萨福克、黑头杜泊较好,澳洲白次之,白头杜泊最差;不同品种母羊连续重复超排冲胚后回收的只均总胚数和只均可用胚数持续增长,直到第4或第5次;澳洲白的超排冲胚效果在春季较好,而其他品种在冬季较好。[结论] 连续重复超数排卵、冲胚技术对于扩繁引进肉羊品种群体是可行的,应根据不同品种及其表现出的季节特性科学、适时应用。