大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。     

K99和ST1双价保护性抗原基因重组苗条表达及其免疫原性研究

大肠杆菌耐热性肠毒素（ＳＴ１）是引起幼畜腹泻的重要毒力因子之一，其结构基因编码１９个氨基酸，无免疫原性。作者以ｐＳＬＭ００４工程菌株为始发菌株，亚克隆ＳＴ１基因，并将ＳＴ１基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因（ｐＳＫ２１９）和ｐＵＣ１８多克隆位点中（ｐＸＳＴ系列）。从而成功构建了能表达ＳＴ１－Ｋ９９两种抗原的工程菌苗候选株ｐＳＫ２１９以及能表达ＳＴ１抗原的工程菌株ｐＸＳＴ     

肌注狂犬病病毒糖蛋白cDNA表达载体诱导的小鼠体液免疫反应

将狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡＢｇｌⅡ（１．６７ｋｂ）片段分别正向插入ｐｍＭＴ－１ＢｇｌⅡ位点和ｐＭＴ０１０／Ａ＋ＢａｍＨＩ位点，构建重组质粒ｐｍＭＴ－Ｒｇｐ和ｐＭＴ０１０／Ａ＋－Ｒｇｐ，通过磷酸钙共沉淀法转染ＢＨＫ－２１细胞，经ＰＣＲ、打点杂交及ＥＬＩＳＡ检测，证明糖蛋白基因发生了整合并获得表达。以该表达载体给小鼠肌肉内注射２～３次，采其注射前、后双份血清，经ＥＬＩＳＡ检测证明，注射了表达载体的小鼠，血清中病毒特异性抗体明显升高，表明狂犬病病毒糖蛋白ｃＤＮＡ在小鼠体内表达后，刺激机体产生了抗该糖蛋白特异性抗体     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１,回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段,再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１,与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接,转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—LacZ融合基因的构建

利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１基因的质粒ｐＢＳＴ２－６和含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ＰＵＣ１８，构建成ＳＴ１－ＬＡＣＺ融合基因。将质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和ＢｇＩＩＩ消化、碱性磷酸酶处理，最后将处理好的ＰＵＣ１８ ＤＮＡ与１４７ ｂｐＳＴ１ ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化不受体菌ＤＨ５Ａ中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴ１基因探针杂交     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ＰＢＳＴ２－６，获得地大肠杆菌耐热性肠素素Ⅰ基因，再将含ＬａｃＺ基因的载体ＰＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切，碱性磷酸酶处理，然后后ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接 酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。     

C型产气荚膜梭菌β毒素基因克隆与核苷酸序列分析

用ＰＣＲ技术,从含Ｃ型产气荚膜梭菌β毒素基因质粒ｐＢ１２中扩增出了０．９５Ｋｂ的β毒素基因,然后用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对其进行双酶切处理,最后将其定向连接在事先经同样内切酶处理的载体ｐＥＴ－２８ｃ（＋）中的相应位点上,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和核苷酸序列分析,证明重组质粒ｐＸＥＴＢ２含有产气荚膜梭菌β毒素基因,确定了其全部的核苷酸序列,并且具有正确的阅读框架     

含PRRS病毒ORF5的伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体的构建

提取伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）ＢａｒｔｈａＫ６１株基因组ＤＮＡ,用限制性内切酶ＫｐｎＩ充分消化,回收５．９ｋｂ片段（Ｊ片段）,将其克隆于质粒ｐＵＣ１１９ ＫｐｎＩ位点上,获得ｐＢＫＪ。用两对针对ＰＲＶ ＴＫ基因的特异性引物对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定,证明其中含有ＰＲＶ ＴＫ基因。然后用ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱。进一步研究证实ＴＫ基因位于其中的     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白菌株的构建

将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴⅠ）结构基因的质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍｍＨⅠ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＳＴⅠ基因片段，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨⅠ消化、碱性磷酸酶处理，然后将处理的ｐＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴⅠＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＤＨ５α。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴⅠ基因探针杂交阳性的菌株。杂文阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后，经限制性内切酶分析和ＤＮＡ序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴⅠ含有２个连接在一起的ＳＴⅠ基因片段，其连接方向是正向的，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴⅠ）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上呈蓝色菌落．表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白。     

鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析

以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。     

猪Haln基因与H-FABP基因研究

本文就Hal^n基因和猪应激综合征的发生机制及其对内质的影响、H-FABP和H-FABP基因与IMF含量关系的相关研究以及两种基因的PCR-RFLPs检测作一综述，旨在为肉质的进一步研究提供基础资料和理论依据。     

基因枪转化技术在动物转基因中应用的研究进展

基因枪转化技术无论在动物还是植物方面都产生了巨大的影响,因粒子介导的转基因方法简单、安全、高效,而越来越被人们所重视。研究结果表明,该转化技术不仅能够用于组织、细胞、器官,甚至可用于一些较难转染的靶目标,同时还可用于体内和体外信息的转换。目前手提式基因枪已广泛应用于皮肤、组织、各种细胞或内脏器官的转染,应用最广的领域是基因治疗,主要包括基因免疫和抑制肿瘤生长。近几年,基因枪技术发展迅速,应用范围越来越广,已经取得了丰硕的成果。作者主要叙述了基因枪转化的基本原理及近年来人们对基因枪转化技术条件的改进,同时就基因枪在动物转基因中的应用和一些主要的研究成果作了阐述,主要包括利用基因枪基因免疫、基因治疗、自杀基因治疗癌症、胚胎转基因、各种动物细胞和器官组织转基因等,并对基因枪技术在动物上应用的优势和不足进行了一些分析,最后展望了基因枪转化技术在动物中的应用前景。     

山羊Myostatin基因打靶载体的构建

根据绵羊、猪、小鼠和牛的Myostatin基因序列,设计引物,通过PCR方法扩增了山羊的Myostatin基因的3′臂、5′臂,其长度分别为1.4kb、4.5kb.将扩增的片段与T载体连接后进行部分序列测定,与已知发表的Myostatin序列进行同源性比较,同源性为100%.对目的片段与载体进行酶切后定向连接形成转基因结构,经序列测定后,证明其插入方向和位置完全正确,构建表达Neo、Tk基因的哺乳动物双标记转基因载体,并命名为ploxp-M .     

促性腺激素释放激素基因及其受体基因的研究进展

作者简要介绍了促性腺激素释放激素基因及其受体基因的位置、结构、表达、调控机理,并初步探讨了这两个基因与繁殖性能的关系。     

抑制素基因免疫大鼠的免疫应答与基因表达

为了研究抑制素基因免疫对大鼠免疫应答和发情的影响及免疫后抑制素的组织分布,将60只大鼠分为5组,每只分别肌肉注射10（T1）、50（T2）、100μg pCIS（T3）,50μg pcDNA3.1（V）和生理盐水（S）。ELISA检测抑制素抗体水平,阴道涂片法检测大鼠的发情状况,免疫组化分析抑制素的组织分布。结果显示,不同剂量抑制素基因2次免疫10 d后抗体P/N值均显著升高（P〈0.05）,3次免疫10 d后T2和T3组抗体P/N值进一步显著升高（P〈0.05）,T3组抗体水平有高于T1和T2组的趋势（P〉0.05）;抑制素基因免疫对大鼠的发情无显著影响;3次免疫2周后心脏、肝脏、接种肌肉部位均未检出抑制素;卵巢、肾脏和垂体部位均检出抑制素;而脾脏部位,抑制素质粒免疫组检出抑制素,对照组则未检出抑制素。这些结果表明,免疫剂量和次数的增加没有导致大鼠产生明显的抑制素免疫耐受,抑制素基因免疫大鼠是相对安全的,抑制素的组织分布结果亦为抑制素基因免疫的作用机理研究提供了理论依据。     

精子载体法获得转人her2基因猪

将带有外源基因的载体酶切纯化后与去精清的猪新鲜精液按比例混合，17℃静置处理使外源DNA进入精子头部，通过人工授精使受体母猪怀孕后产下20头仔猪，经PCR特异性片段扩增，特异片段序列测定和比对，共4头PCR结果为阳性。初步证明人her2基因已在猪染色体上整合，其整合率约为20％。本研究利用精子载体法成功获得了转基因阳性猪，为大动物的转基因研究提供了理论与实践的参考。     

猪流行性腹泻病毒S基因与SEA基因融合表达及免疫原性评价

试验旨在构建pET-28a-S-SEA融合表达质粒,并评价S-SEA蛋白的免疫原性。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,对我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株(GenBank:LT906620.1)的S基因与金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因(GenBank:MH053151.1)进行优化,通过柔性连接肽(GGGGS)连接后,克隆至表达载体pET-28a,得到pET-28a-S-SEA重组质粒,转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测后,对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,将亲和层析后的重组蛋白,免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,对免疫小鼠的血清特异性抗体水平和淋巴细胞增殖指数进行检测。结果成功构建pET-28a-S-SEA质粒,且在大肠杆菌中获得高效表达;小鼠试验结果表明,纯化的S-SEA蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,促进淋巴细胞增殖,具有良好的免疫原性,为进一步研究猪流行性腹泻亚单位疫苗提供帮助。     

牛对氧磷酶1基因和对氧磷酶2基因原核表达载体的构建及其表达分析

为制备和纯化对氧磷酶(PON1和PON2)蛋白做准备，对牛的PON1和PON2基因进行克隆并在大肠杆菌中表达。从牛肝脏组织中用RT-PCR扩增PON1和PON2 cDNA的全长编码序列，连接到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，以IPTG诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE分析表达情况。 结果表明，成功克隆了PON1和PON2两个基因的cDNA的全长编码序列，酶切及测序鉴定证明，获得含有目的基因片段的重组质粒，表达的牛的PON1和PON2融合蛋白以可溶性的形式存在。这为进一步制备和纯化PON1和PON2蛋白，以及探索其在家畜使用寿命中的研究和提高犊牛初生重的作用等方面提供依据。     

酪氨酸酶基因研究进展

酪氨酸酶(TYR)是合成黑色素的限速酶,其活性的高低直接影响着黑色素合成的种类和数量。本文综述了TYR基因结构及功能、表达调控以及该基因在物种上应用研究进展。     

CAST基因研究进展

CAST(calpastatin)基因是钙蛋白酶水解系统成员之一。在一定浓度的钙离子作用下,钙蛋白酶系统主要作用于细胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶,还参与细胞内的信号传递。CAST能促使蛋白质降解减少,导致肌肉增长,还可识别CAPN与钙结合引起的构象变化并与之特异性结合,从而保证钙蛋白酶对底物只进行特定部位的水解。因此,可以通过激活钙蛋白酶或降低钙蛋白酶抑制蛋白的活性来提高肌肉的嫩度,改善肉质。最近的研究表明,CAST基因多态性与家畜的眼肌厚度和眼肌面积存在关联,有望成为提高家畜肉用性能的候选基因。