伊氏锥虫HGPRT缺陷株和自然株的HGPRT基因的分离、克隆与比较

参照布氏锥虫ＨＧＰＲＴ基因的核苷酸序列，设计一对引物，分别以伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株和自然株的总ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，结果自然株出现６３０ｂｐ的ＤＮＡ条带，与设计大小一致，而缺陷株均为阴性，证明缺陷株的ＨＧＰＲＴ基因发生明显突变或缺失。自然株ＨＧＰＲＴ基因经与ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ连接，大肠杆菌转化，获得了阳性克隆。     

伊氏锥虫HGPRT基因的RT-PCR扩增及克隆

参照布氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT)基因的核苷酸序列 ,设计合成了 1对引物 ,引物间距为 63 0 bp,包含完整的 HGPRT基因。以伊氏锥虫湖北水牛株总 RNA为模板进行 RT-PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳显示 ,获得 1条长约 63 0 bp的特异性条带 ,符合设计要求。扩增片段克隆于 p GEM-T Easy载体 ,经筛选鉴定 ,证明已获得了 HGPRT基因阳性克隆。核苷酸序列分析表明 ,克隆的 HGPRT基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。二级结构和疏水性分析表明 ,HGPRT基因产物具有复杂的空间结构 ,提示有良好的抗原性     

理化因素对体外培养伊氏锥虫致弱的影响

本试验观察了理化因素（γ－射线、紫外线、低浓度杀虫药）对体外培养伊氏锥虫致弱的影响，结果如下：受γ－射线辐照的伊氏锥虫开始时存活数随辐照剂量的增加而减少，随后表现出无规律性，辐照剂量５万ｒａｄ以下对锥虫的存活影响较小，５～１０万ｒａｄ辐照后２ｄ锥虫的存活数明显减少，对小白鼠的感染性消失。伊氏锥虫受紫外线照射的存活曲线为“Ｃ”型，群体抗辐射不均一，平均致死剂量（Ｄ＿（３７））为波长２６５０Ａ的２０Ｗ紫外灯离样品４０ｃｍ处照射约２ｈ。虫体照射后根据体外跟踪观察，其存活数随照射剂量的增大而减少，照射了３ｈ和４ｈ第３天的活虫数近似１００条或不足１００条，对小白鼠的感染性均消失。用０．１μｇ／ｍｌ的苏拉灭和０．８μｇ／ｍｌ的贝尼尔两种低浓度杀虫药在体外对伊氏锥虫诱导４０ｄ仅造成药敏性的改变，未造成毒力减弱。     

伊氏锥虫HGPRT缺陷株驯化及生物学特性观察

为了获得伊氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）缺陷株,用不同浓度的８－氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）和８－ＡＧ加紫外线照射的方法,对伊氏锥虫体外培养株进行了为期６０～１０１ｄ诱导驯化。结果,以每毫升含８－ＡＧ４０μｇ的培养液培养驯化,再配合紫外线照射,以及以每毫升含８－ＡＧ６０μｇ的培养液培养驯化,均获得了伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株。试验表明,培养虫体经过２～３个死亡期后逐步进入适应期,虫数升高到（１．５～２．５）×１０６／ｍＬ,饲养细胞通常于２～５ｄ变黑、崩解,应适时更换。培养驯化的１３株克隆虫株,经６－巯基鸟嘌呤（６－ＴＧ）抗性测定,１０株存活。克隆株在３倍量氨基喋呤的ＨＡＴ选择性培养液中死亡。生物学试验表明,ＨＧＰＲＴ缺陷株在无ＨＴ的培养液中生长良好,对小鼠致病力有下隆的趋势,虫血症和小鼠死亡时间比对照组延长１倍多。抗体凝集试验表明,ＨＧＰＲＴ缺陷株未发生抗原变异现象。超微结构显示,ＨＧＰＲＴ缺陷株的动基体、核和核仁比对照组明显增大,核膜电子密度区也明显增宽。     

伊氏锥虫在27℃和41℃的体外培养

用改良Ｂａｌｔｚ无细胞培养系统在２７℃和４１℃培养伊氏锥虫，２７℃培养取得成功，４１℃培养失败。２７℃培养已持续１０个月，培养的伊氏锥虫仍保持其在哺乳动物宿主内的主要形态特征，对小鼠的感染力和致病力，消耗葡萄糖，葡萄糖分解的最终产物为丙酮酸；其群体增倍时间约为２４ｈ，ＤＥＡＥ－纤维素分离的回收率仅５０％左右，显著长于和低于３７℃培养物。文内还讨论了２７℃培养伊氏锥虫的用途和意义。     

伊氏锥虫半—大规模体外培养初报

按改良Ｂａｌｔｚ无细胞培养系统的培养方法，将盛有３００ｍＬ伊氏锥虫培养物，容量１７００ｍＬ（１１．０ｃｍ×２８．５ｃｍ）的培养瓶置于１０ｒ／ｍｉｎ的细胞培养旋转装置上，在３７℃培养箱中培养。在接种虫数为１．５×１０＾５～１０．０×１０＾５／ｍＬ时，其群体增倍时间为１２ｈ。接种虫数为１０×１０＾５／ｍＬ的培养物培养２４ｈ，每瓶收获约１．２×１０＾９锥虫，可满足一般实验的需要。     

伊氏锥虫对杀锥虫药抗性的体外试验

伊氏锥虫对杀锥虫药抗性的体外试验涂洁贵摘译沈永林校１引言随着锥虫病流行地区的抗寄生虫药物广泛应用,开发新的抗锥虫药物来防止抗性的发生尤为紧迫。然而制药厂家对投资开发抗锥虫药兴趣甚微。使今后引进新药明显不可能,因此必须致力保持现有杀锥虫药的效果。在癌症...     

伊氏锥虫半－大规模体外培养初报

按改良Ｂａｌｔｚ无细胞培养系统的培养方法，将盛有３００ｍＬ伊氏锥虫培养物、容量１７００ｍＬ（１１．０ｃｍ×２８．５ｃｍ）的培养瓶置于１０ｒ／ｍｉｎ的细胞培养旋转装置上，在３７℃培养箱中培养。在接种虫数为１．５×１０５～１０．０×１０５／ｍＬ时，其群体增倍时间为１２ｈ。接种虫数为１０×１０５／ｍＬ的培养物培养２４ｈ，每瓶收获约１．２×１０９锥虫，可满足一般实验的需要。     

伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

根据引物设计的一般原则，参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物，PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收：PCR产物，并将其克隆至pGEM—T Easy载体中，经酶切、PCR鉴定和序列分析，获得重组中间质粒pGEM／HGPRT。重组中间质粒pGEM／HGPRT经Nco I和Sal I双酶切，回收目的片段HGPRT，以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV／HGPRT，转化大肠杆菌DH5a，42℃诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析，表达产物HGPRT的分子量约为23kD，与理论推算值相符，表达率占总菌体蛋白的19％，经间接ELISA检测，表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。     

体外培养对布氏锥虫伊氏亚种药敏性的影响

用小鼠治疗试验和体外药敏试验观察了4个布氏锥虫伊氏亚种虫株在长期体外培养条件下药敏性的稳定性.各虫株的原始群体、连续培养30d和90d的群体对贝尼尔、苏拉灭、安锥赛和硫胂聚氰胺的敏感性基本相同,说明连续培养90d各虫株对上述4种抗锥虫药的敏感性无明显改变.     

水牛伊氏锥虫间接ELISA检测方法的建立

利用伊氏锥虫的优势变异型虫体作为可溶性抗原,通过试验研究和条件优化,建立了一种水牛伊氏锥虫间接ELISA方法.测试结果表明,该法灵敏度高,特异性强,对实验感染样本的检测获得了较好的效果,为一种有效的ELIAS方法,为广西水牛伊氏锥虫病的诊断奠定了技术基础.     

伊氏锥虫和布氏锥虫动基体DNA酶切电泳比较

限制性内切酶ＭｂｏＩ，ＤｄｅＩ，Ｈｉｎｆｉ和ＴａｑＩ对布氏锥虫ＫＤＮＡ进行酶切后，电泳中均显示出多条ＤＮＡ区带，其总Ｋｂ数约等于２０ｋｂ，而各限制酶对伊氏锥虫ＫＮＤＡ消化后均显示出１至２条区带，总和约１ｋｂ明显区别于布氏锥虫。     

克隆伊氏锥虫对安锥赛抗药性的培育

为了深入观察伊氏锥虫对安锥赛抗药性的形成,将伊氏锥虫浙江水牛株克隆,克隆繁殖后的虫体一部分作为原种对照组,即C01组;一部分虫体连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,再用安锥赛亚治疗剂量治疗该小鼠,使其伊氏锥虫对安锥赛产生7个不同程度的抗药性组,即C1～C7组;另一部分虫体也连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,作为伴随C7的同步繁殖组,即不用药物的C02组.结果C01、C02、C1～C7组所用安锥赛剂量依次为0、0、6、16、40、80、196、406、638mg/kg,它们经小鼠传代数依次为0、28、1、3、6、9、15、22、28代.用体外生长繁殖抑制法测得它们的ICs0值依次为0.015 50、0.016 87、0.082 60、0.102 37、1.409 29、1.922 90、9.923 30、23.563 00、43.84000.结果表明,安锥赛亚治疗剂量与伊氏锥虫抗药性的IC50值呈曲线关系,从C1到C4的IC50值上升较缓慢,从C4后的ICs0值上升较快,并且几乎呈直线上升;伊氏锥虫所经小鼠的代数与它们的IC50值的关系呈抛物线型,从C1到C4的ICs0值上升很慢,C4以后的IC50值上升很快.用体内试验测试C01～C4组的CD100值,每个组感染35只小鼠,每只小鼠接种1.0×104条锥虫,其中30只小鼠分为安锥赛的3个剂量治疗小组,另5只小鼠为不治疗对照组.结果C01组和C1组的CD100值分别为7.0、13.0 mg/kg,这表明C1组只经1代免疫抑制小鼠,注射安锥赛剂量3×2 mg/kg,就使该组伊氏锥虫对安锥赛的抗药性提高了6 mg/kg,并且它们的IC50值C1是C01的6.6倍.C2、C3和C4组由于抗药性程度过高均不能治愈,因此尚未测到它们的CD100值.这些结果表明,伊氏锥虫经免疫抑制小鼠对安锥赛产生抗药性的速度是非常快的.     

伊氏锥虫对安锥赛抗药性机制的初步探讨

选用克隆伊氏锥虫的安锥赛敏感株 C0 1、C0 3和 5个不同程度抗药株 C1、C2、C4、C6、C7,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离它们的己糖激酶 (HK)、6 -磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6 PDH)、丙氨酸转氨酶 (AL AT)、天冬氨酸转氨酶 (ASAT)同功酶 ,并测定胆碱酯酶活性。结果 ,这 5种酶与伊氏锥虫对安锥赛产生抗药性无关。用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和测定这 7个样品的粗蛋白质 ,结果相对分子质量为 15 790带在抗药株 C1、C2、C4、C6和 C7含量较高 ,这表明它可能与安锥赛抗药性的产生有一定关系 ;相对分子质量为 1976 0带在高抗药株 C4、C6和 C7的含量很高 ,这表明它可能也与抗药性的产生有一定关系     

伊氏锥虫伊犁株扩繁及其PFR基因克隆表达和生物信息学分析

【目的】本研究旨在研究锥虫入侵宿主细胞的机制并为其检测方法的建立奠定基础。【方法】采用已分离保存的伊氏锥虫在昆明白小鼠体内进行培养繁殖,对其鞭毛束旁棒(PFR)基因进行克隆,并构建系统发育树。通过生物信息学方法分析和预测PFR蛋白的理化特性、亲疏水性、跨膜区结构、二级结构和三级结构;构建原核表达载体pET28a-PFR,用Western blotting检测PFR重组蛋白的反应原性。【结果】在昆明白小鼠体内成功扩繁伊氏锥虫伊犁株,第5天染虫率达到最高;PFR基因PCR扩增片段大小为834 bp,与冈比亚布氏锥虫PFR基因(XP＿011775815.1)相似性为99.52%,基于PFR蛋白氨基酸序列的进化树显示,该虫株与冈比亚布氏锥虫的亲缘关系也最近。PFR蛋白分子式为C₁₄₁₆H₂₂₈₆N₄₁₆O₄₄₂S₁₁,理论等电点为5.74,是一种碱性、亲水性及不稳定蛋白,没有跨膜区和信号肽,有10个潜在抗原表位;主要定位于细胞质中;PFR蛋白二级结构主要由α-螺旋组成(占92.34%)...