绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白基因重组与鉴定

为了获得高表达量重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白 ,以用作免疫原 ,从含有目的片段 (10 0 0 bp)的 p ET- 2 0 (b) B1 0 质粒切下目的片段 ,以正确阅读框架插入含有 T7lac启动子的 p ET- 2 8c( ) DNA中 ,构建了p ET- 2 8c( ) B1 0 质粒。用该质粒转化大肠杆菌 BL2 1 (DE3 )、BL2 1 (DE3 ) p L y S,经 IPTG诱导 ,BL2 1 (DE3 ) p L y S能高效表达目的蛋白。 SDS- PAGE、Western blot分析证实 ,该蛋白即是所需的蛋白 ,该重组蛋白占菌体总蛋白的 5 8%。     

绿脓杆菌外毒素A的纯化

用绿脓杆菌ＰＡ１０３株接种于ＴＳＡ甘油培养基３２℃培养，产生绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ），经流水透析除盐、ＤＥ－５２纤维素阶段洗脱、硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５除盐、ＤＥ－５２纤维素梯度洗脱、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００分子筛层析，纯化了绿脓杆菌外毒素Ａ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，纯化后的毒素为单一蛋白带，分子量约６６０００；对普通小鼠ＬＤ５０为０．２４μｇ蛋白。用ＰＥＡ抗血清作免疫印迹分析，进一步证实纯化的蛋白为ＰＥＡ，毒素约纯化了５００倍，总蛋白回收率约０．０２４％，毒素回收率约１１％。     

重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白动物免疫保护试验

将绿脓杆菌外毒素A（PEA）受体结合区基因重组质料pET-28(c) B10转入大肠杆菌BL21（DE3）plys,诱导表达出的重组PEA受体结合区蛋白包涵体经脲素洗涤后，Sephacryl-2000分子筛层析，DEAE－SepharoseFF离子交换层析获得纯度为95．8％重组蛋白包涵体，将该蛋白免疫原免疫小鼠后，用PEA进行不同时间攻毒，观察到最佳保护时间为14d左右，主要的病理变化出现在肝脏和肾脏。     

含绿脓杆菌外毒素A受体结合区重组蛋白的纯化

将表达含绿脓杆菌外毒素（ＰＥＡ）受体结合区基因的质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,经ＩＰＴＧ诱导表达了含ＰＥＡ受体结合区的重组蛋白（称ＰＥ３４）。ＰＥ３４主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中,用溶菌酶－脱氧胆酸钠法结合超声波裂解法破碎细菌,离心制备包涵体。用２ｍｏｌ／Ｌ脲洗涤包涵体后,包涵体纯度可达７５％,在８ｍｏｌ／Ｌ脲存在条件下,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶滤过,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化,获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ１条带的ＰＥ３４,纯度达９５．８％,得率为２４．５％。     

猪水肿病毒素A亚单位基因的克隆及表达的尝试

以聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术从大肠杆菌ＴＢ１中扩增出猪水肿病毒素（ＳＬＴ－ＩＩｅ）的Ａ亚单位基因的９６０ｂｐ。将此ＰＣＲ扩增产物（ｓｌｔ－ＩＩｅＡ）在ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ位点间克隆进质粒ｐＵＣ１８中,获得了重组质粒ｐ１８ｓｌｔ－ＩＩｅＡ,经ＭｉｃｒｏＧｅｎｉｃ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ分析证明在其整个序列中含有与已发表的ｓｌｔ－ＩＩｅ序列相同的序列,说明质粒ｐ１８ｓｌｔ－ＩＩｅＡ是含有     

绿脓杆菌PA-SD-1株外毒素AⅢ区基因的克隆及序列分析

利用PCR技术，以绿脓杆菌羊分离株（暂命名为PA－SD－1株）的染色体DNA为模板，成功扩增出该菌的主要致病基因（绿脓杆菌外毒素A）Ⅲ区基因。将该PCR扩增片段与pPGEM^R-T Easy载体连接，获得了含有目的片段的重组质粒（命名为PA－SD－ETA）。序列测定结果表明。该菌株与其他已报道的绿脓杆菌菌株有较高的同源性，而局部出现单个碱基的点突变。点突变导致的氨基酸的性质有较大改变。     

重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白的初步复性及细胞生物学活性检测

用逐步稀释透析法将纯化的大肠杆菌表达的重组绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）受体结合区蛋白初步复性,复性后的可溶性蛋白用于竞争抑制ＰＥＡ的细胞毒性实验。将１０μｇ／Ｌ的ＰＥＡ与其敏感细胞Ｌ９２９共孵育,３６ｈ左右可见细胞发生病变死亡,而同时加入复性的重组ＰＥＡ受体结合区蛋白的培养细胞孔与未加ＰＥＡ阴性对照培养细胞一样仍分裂增殖,这种ＰＥＡ细胞毒性抑制作用可持续到所有培养细胞老化死亡。结果表明,重组ＰＥＡ受体结合区蛋白可在体外竞争抑制ＰＥＡ对Ｌ９２９细胞的毒性。     

重组绿脓杆菌外毒素A受体结构区蛋白的初步复性及细胞生物学？…

用逐步稀释透析法将将纯化的大肠杆菌表达的重组绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）受体结合区蛋白初步复性,复性后的可溶性蛋白用于竞争抑制ＰＥＡ的细胞毒性实验。将１０μｇ／Ｌ的ＰＥＡ与其敏感细胞１．９２９共孵育,３６ｈ左右可见细胞发生病变死亡,而同时加入复性的重组ＰＥＡ受体结合区蛋白的培养细胞也与未加ＰＥＡ阴性对照培养细胞一样仍分裂增殖,这种ＰＥＡ细胞毒性抑制人作用可持续到所有培养细胞老化死亡,结果表明,重组Ｐ     

抗绿脓杆菌外毒素A酶标抗体的制备及其应用

从病死羊体内分离到绿脓杆菌并提取出外毒素A(PEA),再以此毒素作为抗原加油佐剂制成乳化抗原免疫家兔,获得高免血清并提取免疫球蛋白G(IgG);用过碘酸钠法将过氧化物酶标记抗PEA抗体(IgG),制成酶标抗体,经检验,酶标抗体结合物中的HRP浓度和Ab(IgG)浓度分别是0.0608 mg/mL和0.336 mg/mL;HRP/Ab(IgG)克分子比值为1.724%;酶(HRP)结合率是11.15%.利用该酶标抗体以ELISA夹心法对羊体内抗PEA抗体含量进行了检测,结果证明,用酶标抗体ELISA法比用平板凝集实验法检测的抗体效价平均高出二个滴度,表明制备的PEA酶标抗体具有灵敏度高、特异性强的优点.     

绿脓杆菌外毒素A recA基因的融合及融合蛋白的表达

将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析，ＰＥＡ－ＲｅｃＡ与它们都有免疫学反应     

F18ac菌毛A亚单位基因的克隆与序列分析

根据已经发表的F18ab菌毛A亚单位(FedA/ab)的基因(fedA/ab)[1],设计一对引物,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌2134P株[2]、8199株[3]、8813株[3]中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒T2134PA、T8199A、T8813A.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该3个序列大小均为516bp,与fedA/ab(513bp)具有较高的同源性,分别为96.3%、96.5%、95.9%,推导的Fed/ac氨基酸序列与FedA/ab同源性分别为93.0%、93.6%、92.4%.数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛A亚单位(FedA/ac)的基因(fedA/ac).     

重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性

为了观察重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白在不同动物体内的免疫效果 ,将该蛋白纯化后免疫了小鼠、家兔、山羊等动物。对小鼠进行了攻毒实验 ,通过 EL ISA方法检测了家兔、山羊血清中抗体的消长规律。结果对小鼠的保护情况为 :最后 1次免疫后 14 d小鼠对 3倍 L D50 的 PEA攻毒保护率为 10 0 % ,2 1d保护率为 5 0 % ,2 8d后无保护效果。家兔和山羊免疫后 7～ 14 d达到峰值 ,2 1d后逐渐降低 ,2 8～ 35 d后降至免疫前水平     

新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达

本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础.     

成熟志贺毒素A亚单位(ShT-A)全长与截短片段在E.coli中的表达及多抗制备

根据GenBank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列，设计合成了2对引物，分别进行PCR扩增，将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM—TA2。用BamHⅠ和KpnⅠ以及BamHⅠ和XhoⅠ双晦切pGEM-TA1和pGEM—TA2．均得到大小为895bp的ShT-A基因片段，分别与pQE30和pET21a（＋）原核重组表达载体连接．构建pQE30-A2和pET-21A，原核重组表达质粒。工程菌M15／pQE30-A2和BL-21／pET-21A1经lPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E．coli细胞产生毒性作用。DNAsis软件分析ShT-A基因序列，发现在513bp处有HindⅡ位点．以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅡ从pGEM-TA。切出1个513bp的截短片段．重新插入表达载体pQE30．经PCR和双酶切鉴定正确后，得到pQE30-A513重组表达质粒．转化E．coli M15经IPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，在20000处出现1条特异性的表达蛋白带．与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析，试截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37．4％，主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明．表达的重组ShT—A513，蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。     

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因的多样性分析

根据已经发表的大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位(FedA／ab)的基因序列(fedA／ab)设计1对引物，利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(F107／86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列．并克隆至pGEM-T载体，获得重组质粒TF107A、TYCED1A、TYCED2A、TCA、TDA、TEA、T12FA、T8813A、T8199A、T2134PA。通过序列测定，并与已发表的fedA／ab进行比较、基因树分析，可将这10个菌株分为2个基因群，其中F107／86、YCED1、YCED2、C、D、12F与fedA／ab具有高度同源性，属于fedA／ab．大小为513bp；E、8813、8199、2134P构成另一单独的分支，属于fedA／ac．大小为516bp。     

皮蝇Hypodermin A基因的克隆及表达质粒构建

参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建

提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用Xho Ⅰ、Xba Ⅰ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的裁体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确.     

金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因（fnbA）序列设计了1对特异性引物，以金黄色葡萄球茵基因组DNA为模板，进行PCR扩增；结果获得了3600bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pGEM T easy载体中，成功地构建了克隆质粒pGEM—fnbA。以HindⅢ和XhoⅠ双酶切pGEM-fnbA和pET28a（＋），将纯化的基因fnbA亚克隆至pET28a（＋）中，构建了原核表达质粒pET28a-fnbA，并将其转化至E．coli BL21（DE3）感受态细胞中，经1mmol／LIPTG诱导和SDSPAGE分析，在约165ku处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带。Western—blotting分析表明，该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。     

猪JHDM2A基因的克隆及表达分析

试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。