可可毛色二孢拮抗菌的鉴定及发酵条件优化

【目的】筛选对可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)具有拮抗作用的生防菌株,为由可可毛色二孢菌引起的槟榔根腐病的生物防治提供菌种资源及指导。【方法】以海南发病槟榔园健康槟榔根组织及根际土壤为试验材料,采用组织匀浆法和平板稀释梯度培养法分别分离槟榔根内生细菌及根际土壤中的细菌,应用平板对峙法筛选出对可可毛色二孢菌具有拮抗作用的菌株;通过平板对峙法测定拮抗菌株菌液对3种槟榔根部病害病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、奇异根串珠霉菌(Thielaviopsis paradoxa)和可可毛色二孢菌的抑制作用;通过形态学观察、生理生化测定和16S r DNA序列分析对拮抗菌株进行鉴定;采用盆栽试验初步验证拮抗菌株对由可可毛色二孢菌引起的槟榔根腐病的防治效果;采用单因素变化试验等筛选拮抗菌株的最佳发酵条件。【结果】经平板对峙法筛选出5株拮抗作用较强的菌株,其中菌株wrj-2-5的抑菌率最高,为74.07%;菌株wrj-2-5菌液对可可毛色二孢菌、尖刀镰刀菌和奇异根串珠霉菌菌丝生长均有较强的抑制作用,抑制率均在70.00%以上。综合菌株形态学观察、...     

橡胶树可可毛色二孢叶斑病菌生物学特性及药剂筛选试验

由可可毛色二孢菌引起的橡胶树叶斑病是广东、海南、云南地区橡胶树的一种新病害,通过对该病原菌生物学特性研究和室内高效低毒化学药剂筛选,为该病害的防治提供理论依据。选取经鉴定的主要代表菌株,采用实验室常规法研究该病原菌的生物学特性,并用菌丝生长速率法测定10种杀菌剂对病原菌的毒力。结果显示其菌丝最适生长温度为30℃;最适生长pH范围为6~8;致死温度为53℃处理10min;最适菌落生长碳源为葡萄糖,最适氮源为牛肉浸膏;不同光照条件对菌丝生长有影响,在24h光照菌丝生长最快。10种杀菌剂对可可毛色二孢的毒力差异显著,其中多菌灵EC50最低,为0.0675μg/mL;其次为甲基硫菌灵,EC50为0.2019μg/mL。可见,橡胶树可可毛色二孢是一种适应性极强的高温适生菌;杀菌剂室内毒力测定结果表明,可以用多菌灵、丙环唑、甲基硫菌灵、苯醚甲环唑等药剂防治橡胶树可可毛色二孢叶斑病。     

引起墨西哥葡萄藤溃疡病的可可毛色二孢和色二孢属真菌的鉴定和致病性

在墨西哥下加福利亚州和索诺拉州的葡萄（Vitis vinifera L．）种植面积超过2．6万hm^2。上述地区是墨西哥最大的葡萄酒和鲜食葡萄产区,每年葡萄的产值为1．52亿美元。1979年在墨西哥阿瓜斯卡连斯特和Coahuila-Durango,第一次发现葡萄产业的衰退,它与引起葡萄藤顶枝枯萎的葡萄藤猝倒病菌[Eutypa Lata（pers．）]有关。新近十年葡萄溃疡病和随后葡萄顶枝枯萎在索诺拉的埃莫西鲜食葡萄园观察到。其病害特征是由于在维管组织内形成溃疡,     

老枞根际放线菌鉴定及其对可可毛色二孢抑制效果研究

【目的】从老枞根际土壤分离可培养放线菌,获取潜在新物种,并筛选可可毛色二孢菌拮抗菌株。【方法】采用土壤稀释涂布法和三区划线法进行分离和纯化,获得放线菌菌株;通过比对16S rRNA基因序列和构建系统发育树,对菌株进行初步分类和鉴定;采用平板对峙法进行抑菌活性筛选。【结果】（1）共获得81株不同放线菌菌株,分别隶属于链霉菌Streptomyces(54.32%)、节杆菌Arthrobacter(27.16%)、微杆菌Microbacterium(11.11%)、北里孢菌Kitasatospor(4.94%)和短小杆菌Curtobacterium(2.47%)5个属;（2）与已知模式菌株相比,相似度小于98.65%的潜在新种共有20株;（3）经可可毛色二孢平板对峙试验筛选后,获得7株高抑菌活性链霉菌,其中链霉菌ON316885的抑菌率最高,达到63.92%。【结论】武夷山老枞根际土壤中蕴含着丰富的放线菌资源,具有深度挖掘研究的价值,其中一些链霉菌具有较高的生防应用价值。     

基于全基因组预测和分析花生果腐病原菌分泌蛋白

【目的】为分析花生果腐病病原菌-新孢镰刀菌的侵染机制并筛选可用基因。【方法】以全基因组测序结果为基础,根据分泌蛋白与效应因子的特点,采用SignalP、TMHMM、WoLF PSORT及NetGPI等软件一步步筛选,对新孢镰刀菌全基因组12 756条蛋白序列进行了分泌蛋白预测和功能分析。【结果】新孢镰刀菌全基因组编码蛋白中有701条序列具有典型的分泌蛋白特征,占蛋白总数的5.49%,其长度主要分布在101～700个氨基酸范围内。信号肽的分析结果表明,信号肽-3和-1位置的氨基酸相对保守,其切割位点属于典型的A-X-A型。对分泌蛋白功能预测结果表明,656个分泌蛋白获得了功能注释,其功能主要涉及碳水化合物的运输、代谢过程,蛋白翻译后修饰和氨基酸代谢、运输过程。分泌蛋白中效应蛋白预测结果表明,新孢镰刀菌分泌蛋白中共有161个潜在的效应蛋白。【结论】对新孢镰刀菌分泌蛋白的有效预测和功能分析,为筛选新效应蛋白,明确其致病机理,筛选寄主抗性基因奠定了基础。同时为花生果腐病抗性品种选育和综合防治提供理论依据。     

多杀性巴氏杆菌基因组分泌蛋白的预测分析

分泌蛋白对于细菌自身的生命活动以及在介导病原体与宿主之间相互作用的过程中发挥着重要的作用,深入研究分泌蛋白将有助于明确细菌的生命活动及与病原微生物互作的分子机制.利用多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)基因组学研究成果,结合信号肽分析软件SignalP v3.0、跨膜螺旋结构软件TMHMM v2.0、亚细胞器蛋白定位软件PSORTb和GPI-锚定位点软件GPI-SOM这4个软件,对多杀性巴氏杆菌2105个编码蛋白的ORF进行预测分析,最终获得了136个分泌蛋白.对其信号肽长度、氨基酸组成、相应ORF长度进行了统计.运用Blast P对其功能进行同源性分析,发现11个蛋白为多杀性巴氏杆菌所特有,这对多杀性巴氏杆菌的临床诊断具有一定的潜在应用价值.     

桑毛色二孢根腐病菌遗传多样性的ISSR分析

[目的]明确来源于广西各地桑树根腐病病原菌可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae Pat.)的遗传多样性特征,为桑树抗病育种提供参考依据.[方法]以从广西各桑树种植区采集、分离的44株L.theobromae菌株为材料,利用真菌基因组DNA提取试剂盒提取参试菌株的基因组DNA;从加拿大哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列中随机选择60条引物先对8株菌株的DNA进行预扩增,选用扩增条带数量多、条带清晰的引物对所有参试菌株的DNA进行扩增,统计每条引物的扩增条带数形成0、1矩阵;利用NTSYSpc(Version 2.10e)计算不同菌株间的遗传相似系数,采用非加权组平均法构建系统发育聚类图,并进行聚类相关分析;利用PopGene(Version 1.32)分析不同地理来源和寄主来源菌株的遗传分化程度.[结果]ISSR分子标记结果显示,44株参试菌株(7个居群)的多态位点百分率在92.00%以上;7个居群的平均遗传一致度(IN)和平均遗传距离(D)分别为0.7363和0.3108;44株参试菌株的平均基因多样性指数(H)和Shannon's信息指数(I)分别为0.3263和0.4841,均高于7个居群的平均值(0.1256和0.1796);对应的遗传分化系数(Gst)、基因流值(Nm)分别为0.6142和0.3141.[结论]广西地区桑毛色二孢根腐病菌菌株具有较高的多态性,菌株间的遗传多样性高于居群,遗传多样性与菌株的地理来源有关.     

剑麻可可毛色二孢叶斑病菌的鉴定及其室内药剂筛选试验

【目的】剑麻是我国重要的麻类作物,在广东湛江地区剑麻上发生一种叶斑病,导致剑麻叶片大面积坏死,严重影响产量。明确剑麻叶斑病的病原菌种类及防治药剂,以期对该病进行有效防治。【方法】采用组织分离法对病原菌进行分离,经科赫氏法则验证后得到病原菌的纯培养,结合真菌的形态特征和ITS序列分析对该病原菌进行鉴定,通过带毒介质菌丝生长速率法测定该病原真菌对不同药剂的敏感性。【结果】从广东湛江剑麻产区分离得到叶斑病致病菌,分生孢子椭圆形,单孢,深褐色,中间有一条中横隔隔开,形似双胞结合在一起,ITS序列比较分析表明其与可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）的同源性达到99%以上。百菌清、己唑醇、咪鲜胺、戊唑醇、苯醚甲环唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌灵等7种药剂对可可毛色二孢菌均具有较好的抑菌效果,其中百菌清抑菌效果最好,EC50值为0.000132μg/m L。【结论】广东湛江地区发生的剑麻叶斑病初步鉴定为由可可毛色二孢真菌引起,该病原菌对百菌清、己唑醇、咪鲜胺、戊唑醇、苯醚甲环唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌灵等药剂敏感。     

全基因组预测稻瘟菌的分泌蛋白

【目的】分泌蛋白多为病原微生物与植物受体蛋白起作用的激发子和其它致病因子，深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。利用稻瘟菌基因组学研究成果，结合计算机技术和生物信息学的方法，分析其分泌蛋白组学，将有助于全面掌握其致病因子的结构与功能。【方法】利用SignalP对稻瘟菌基因库中所有ORF的N-端信号肽存在与否进行预测，再依次通过Protcomp、TMHMM、big-PI Predictor和TargetP预测程序进行验证，寻找出所有可编码信号肽的基因。【结果】对11 108个稻瘟菌的ORF进行分析，最终预测出共有1 235个ORF可编码分泌蛋白。【结论】经验证此预测方法之可靠性较高，这为深入研究分泌蛋白组学奠定了基础。     

全基因组预测枯草芽孢杆菌BEST195的分泌蛋白

枯草芽孢杆菌BEST195作为纳豆菌的一种,是纳豆生产的重要菌株之一。利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等预测程序对该菌中4456条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度大小、信号肽切割位点等性质进行分析。结果表明：枯草芽孢杆菌含有分泌蛋白102个,其氨基酸长度、信号肽长度与植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A X A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了枯草芽孢杆菌BEST195分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守型特点。     

Computational Analysis of Signal Peptide-Dependent Secreted Proteins in Saccharomyces cerevisiae

Computer based software such as the SignalP v3.0, TargetP v1.01, big-PI predictor and TMHMM v2.0 were combined to predict the signal peptides, and the signal peptide-dependent secreted proteins among the 6 700 ORFs in genome of Saccharomyces cerevisiae. The results showed that 163 proteins were the secreted ones containing signal peptides, and they were secreted via Sec pathway. Among the 163 predicted secreted proteins, the signal peptides of 47 secreted proteins included only the H-domain and C-domain, without N-domain, but the signal peptides of other 116 secreted proteins included all the three domains. There were differences in the constitution of signal peptides between the secreted proteins of S. cerevisiae and of Candida albicans, but the length and amino acids types of their signal peptides were similar in general. Few of the same signal peptides occurred in the secreted proteins of S. cerevisiae genome, and the homology could be compared among the secreted proteins with the same signal peptides. The BLAST 2 SEQUENECES and CLUSTAL W were used to align the two protein sequences and multi-protein sequences, respectively. The alignment result indicated that homology of these sequences with the same signal peptide was very highly conservative in amino acid of complete gene. The effect of the signal peptides in S. cerevisia on expression of foreign eukaryotic secreted proteins is discussed in this paper.     

褐环乳牛肝菌中分泌蛋白的理化性质分析

为了更好地明确褐环乳牛肝菌分泌蛋白的功能,基于前期所获得327个分泌蛋白序列,对其理化性质进行分析。结果表明,69.72%的分泌蛋白理论等电点小于6.0,属于酸性蛋白,同时,利用随机数生成软件对上述不同理论等电点类别的分泌蛋白进行10%抽样分析,明确33个不同理论等电点类别的分泌蛋白(包括23个酸性蛋白、4个中性蛋白、6个碱性蛋白)的分子质量、分子式、原子数量、半衰期、不稳定性系数、脂肪族氨基酸指数、总平均亲水性等理化性质,其中14个分泌蛋白为稳定性蛋白,14个分泌蛋白为亲水性蛋白。     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析

利用信号肽分析软件SignalP v3．0，亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1．01，GPI-锚定位点软件big—PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2．0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框（ORF）最小值为78bp，最大值为7849bp，平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15—45个氨基酸之间，平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述，主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类，提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae VdLs.17）分泌组预测及分析

 【目的】预测并分析大丽轮枝菌基因组范围内的分泌蛋白,为大丽轮枝菌分泌蛋白致病机理的研究奠定基础。【方法】利用已公布的大丽轮枝菌全基因组序列,组合使用生物信息学软件SignalP、TargetP、TMHMM、Big-pi和PROSITE,预测大丽轮枝菌基因组范围内所有分泌蛋白,定义为分泌组。统计分析分泌组中蛋白N-端信号肽特点;应用碳水化合物活性酶类数据库和病原菌-寄主互作蛋白数据库对分泌组蛋白进行注释,预测分泌组中潜在果胶酶、纤维素酶和病原菌寄主互作蛋白;利用真菌激发子的保守结构域,预测分泌组中潜在的激发子蛋白集;应用BLASTP程序比较分析大丽轮枝菌和黑白轮枝菌分泌组,获得大丽轮枝菌相对于黑白轮枝菌特异的分泌蛋白。【结果】大丽轮枝菌分泌组共有922个蛋白。信号肽分析表明,以19个氨基酸为信号肽的蛋白数目最多,非极性氨基酸丙氨酸的出现频率最高,而有带电侧链的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的出现频率最低,信号肽的-3和-1位置上的氨基酸相对保守。大丽轮枝菌分泌组含有158个潜在的碳水化合物活性酶类,其中,包括10个果胶水解酶和14个果胶裂解酶;190个潜在的病原菌-寄主互作蛋白、97个含有RxLx[EDQ]模体的蛋白和52个富含半胱氨酸的小分子量分泌蛋白;58个相对于黑白轮枝菌分泌组特异的蛋白。【结论】本文建立了预测大丽轮枝菌分泌组蛋白的方法。分泌组蛋白信号肽长度具有高度的变异性,氨基酸组成多为脂肪族氨基酸,序列在C-端结构域较为保守。分泌组中包含大量潜在的果胶降解酶、病原菌-寄主互作蛋白、RxLx[EDQ]模体蛋白和富含半胱氨酸的小分子量蛋白等致病相关蛋白。     

酿酒酵母分泌蛋白组的计算机分析

 结合计算机技术和生物信息学的方法，采用组合的信号肽分析软件SignalP v3.0、TargetP v1.01、Big-PI predictor和TMHMM v2.0对已公布的6 700个酿酒酵母（Saccaromyces cerevieiae）基因的N-端氨基酸序列进行信号肽分析，同时系统分析了信号肽的类型及结构。结果表明，在6 700个酿酒酵母蛋白中，163个为Sec-信号肽分泌蛋白，经Sec途径分泌。在163个分泌蛋白中，有47个的信号肽没有典型的N-区，仅有H-区和C-区，其余116个分泌蛋白的信号肽包含完整的3个区，即N-区、H-区和C-区。比较了酿酒酵母与白假丝酵母菌(Candida albicans)分泌蛋白信号肽的氨基酸组成顺序，表明酿酒酵母与白假丝酵母菌的信号肽的氨基酸组成和顺序差异很大，两者信号肽长度分布范围、氨基酸种类及其出现频率大体一致。在酿酒酵母分泌蛋白中出现了少数氨基酸组成完全一致的信号肽，为进一步确认具有相同信号肽的分泌蛋白是否具有同源性，分别采用BLAST 2 SEQUENECES 和CLUSTAL W 对具有相同信号肽的分泌蛋白进行了序列比对。结果表明具有相同信号肽的分泌蛋白同源性非常高，氨基酸组成也非常保守。由此可以推断，编码这些分泌蛋白的基因属于旁系同源基因（paralogous）。酿酒酵母作为一种模式生物，以其诸多的优点，被认为是表达真核外源蛋白的首选宿主。对酿酒酵母进行基因组水平的分泌蛋白及信号肽结构的分析，可更好地利用该宿主表达分泌型的外源蛋白研究提供参考信息。     

小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中编码分泌蛋白的序列预测

【目的】植物与病原菌互作过程中,涉及许多可以与植物受体蛋白相互识别、引发植物防卫反应的病原菌激发子或其他致病因子,其中多数为分泌蛋白,深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。【方法】通过SignalP v3.0、TMHMM v2.0、TargetP v1.1、Protcomp v6.0 4个软件,对陕西省农业分子生物学重点实验室构建的小麦条锈菌萌发夏孢子cDNA文库中854条EST序列进行分泌蛋白预测。【结果】得到具有可溶性分泌信号肽的蛋白编码序列33条,占测定序列的3.86%,其中最小长度为196 bp,最大为1 096 bp,分泌信号肽切割位点基本位于15~42个氨基酸,平均为37个氨基酸。【结论】预测得到的分泌蛋白编码序列,可以作为小麦与条锈菌互作过程中的激发子和致病因子备选基因来进一步研究。