磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的异源表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏好性,在不改变编码蛋白的基础上,优化设计并合成枯草芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因,将其与大肠埃希菌 乳酸乳球菌穿梭质粒pAMJ399连接,构建重组质粒pAMJ399 PIPLC,并电转化至乳酸乳球菌中进行诱导表达。SDS PAGE分析显示：重组蛋白以可溶性蛋白的形式分泌于胞外,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。重组蛋白在PI 李斯特氏菌显色平板上显现明显的乳白色晕圈,证明重组蛋白具有酶活性,磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI PLC）在重组乳酸乳球菌中成功获得表达。通过优化培养条件,以2%转接量,在含有1%红霉素抗性的GM17液体培养基中,于32 ℃静止培养24 h,测得培养基上清液中PI PLC的浓度为1.092 μg·mL-1。     

玉米钙依赖蛋白激酶全基因组鉴定及抗旱表达分析

【目的】分析研究玉米钙依赖蛋白激酶全基因组鉴定及抗旱表达。【方法】使用NCBI Blast、DNAMAN和MotifScan等程序分析玉米钙依赖蛋白激酶CDPK的蛋白结构域和系统发育。采用Real-time RT-PCR方法分析CDPK基因在干旱胁迫处理玉米幼苗中的表达,评价CDPK基因对玉米干旱胁迫反应能力。【结果】鉴定出了在玉米中含有39个CDPK基因。将CDPK基因分为4个组。每个群体中的成员有共同的蛋白质基序和外显子及内含子结构,共同的进化起源。39个玉米CDPK基因根据它们的系统发育关系分组,并锚定在特定的玉米染色体上。多数CDPK基因在玉米干旱胁迫中的表达水平发生改变,CDPK基因参与对干旱胁迫的响应。【结论】从玉米基因组数据库中鉴定出了39个CDPK基因,大多数玉米CDPK基因在不同组织和不同发育阶段表现出不同的表达水平,CDPK基因在玉米发育中发挥不同的作用。多数CDPK基因在干旱胁迫下的表达量均发生变化。     

拟南芥非特异性磷脂酶C2的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C活性研究

在拟南芥中有6个非特异性磷脂酶C(NPC1~NPC6)。GUS染色显示NPC2在根中主要是在根尖分生区和伸长区表达,在成熟区主要是在维管组织中表达;在叶中,NPC2主要在发育的叶片中表达,随着叶片成熟进程,NPC2基因的表达量逐渐降低。npc2-1突变体的PC-PLC活性比野生型降低47.7%,互补的植物能不同程度地恢复突变体的PC-PLC酶活性。这说明NPC2具有PC-PLC酶活性。NPC2基因在侧根形成位点的表达虽然与IAA诱导的侧根形成紧密相关,但外源IAA处理野生型和突变体之间的侧根密度、主根长度和侧根总长无明显区别。     

小麦OSCA基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】在全基因组水平对小麦(Triticum aestivum L.)OSCA家族成员（TaOSCAs）进行鉴定,以明确TaOSCA在小麦中的潜在生物学功能。【方法】利用BLASTP结合保守结构域筛选的方法鉴定小麦TaOSCA蛋白。用生物信息学方法分析TaOSCA基因家族成员系统发育关系,基因结构及跨膜结构域;利用公开的转录组数据分析TaOSCA在小麦不同发育阶段不同器官/组织的表达谱;以小麦品种中国春为材料,进行PEG-6000模拟的渗透胁迫处理,用实时荧光定量PCR检测叶片TaOSCAs在渗透胁迫下表达模式。【结果】从小麦中鉴定到35个TaOSCA蛋白;TaOSCAs分为TaOSCAⅠ、TaOSCAⅡ、TaOSCAⅢ和TaOSCAⅣ 4个亚家族,分别有15,16,3和1个成员。基因结构分析结果表明,除TaOSCA4.1-4B外,其余TaOSCA均包含多个外显子。跨膜结构域分析结果表明,除TaOSCA2.3-4B有5个跨膜结构域（TMs）外,其余TaOSCA成员均包含8～11个TMs。TaOSCAs在小麦不同发育时期各器官中的表达结果表明,TaOSCA1.1-3B/3D、TaOSCA1.2-1A/1B/1D、TaOSCA1.3-1A、TaOSCA1.6-1A/1D和TaOSCA3.1-2B/2D在全生育期高水平表达,TaOSCA1.4-2A/2B/2D在不同发育阶段的根组织中均高表达,TaOSCA1.5-1B/1D在生殖生长期穗中高表达,TaOSCA1.6-1B、TaOSCA2.6-3B/3D在生殖生长期籽粒中高表达,表明这些基因可能在根、穗及籽粒发育过程中发挥重要功能。渗透胁迫处理下,TaOSCA2.4和TaOSCA4.1表达下调,TaOSCA2.5的表达无显著变化,TaOSCA1.1、TaOSCA1.2等11个TaOSCA基因表达上调,说明这11个基因可能在小麦苗期响应渗透胁迫中发挥作用。【结论】TaOSCA基因可能在小麦响应渗透胁迫的过程中发挥重要作用。     

小麦水通道蛋白基因家族的全基因组鉴定及其在盐和干旱胁迫响应中的作用

水通道蛋白(AQPs)的功能是选择性地控制水和其他小分子通过细胞膜的流动,它们在植物的许多生理过程中都是至关重要的,包括非生物胁迫反应.小麦(Triticum aestivum L.)是全球重要的粮食作物,但干旱和盐胁迫是小麦生长和产量形成的重要影响因素.共鉴定得到了 127个非冗余的小麦水通道蛋白基因和4个可变剪接体.对TaAQP基因进行了 RNA-seq分析,揭示了小麦AQP基因的特异性表达模式.其中,TaTIPs和TaPIPs的表达高于TaNIPs和TaSIPs.qRT-PCR分析表明,小麦在干旱和盐胁迫条件下,TaNIP4;03_3D,TaTIP2;02b_7B,TaSIP2;02_4A,TaNIP3;03_6D 和 TaNIP2;04a_7D 等 AQPs 受到显著诱导并且有高表达量,表明它们参与了胁迫响应.这些结果为进一步探索TaAQPs基因在植物应对干旱胁迫和盐胁迫中的作用提供了新的思路.     

肌醇对小麦萌发期耐盐性的调节作用 及生理机制分析

以小麦品种西农979为材料,确定了用于小麦盐胁迫的NaCl浓度为300 mmol·L~(-1),然后通过添加1、2、4、8 mmol·L~(-1)的肌醇,观测在肌醇作用下小麦种子发芽率及丙二醛(MDA)含量。结果发现8 mmol·L~(-1)外源肌醇可使受盐胁迫的小麦种子7 d发芽率提高21. 3%,MDA含量下降41. 8%,MDA含量接近未受胁迫的小麦水平。同时,检测了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性,添加肌醇使盐胁迫下小麦SOD和CAT酶活性分别提高22. 9%、15. 0%,POD酶活性降低19. 7%。研究表明,肌醇显著降低盐胁迫下小麦发芽期的丙二醛含量,对盐胁迫下小麦的损伤起到了一定的缓解作用。     

大白菜ACA基因家族的全基因组鉴定与表达分析

【目的】通过对大白菜ACA（Ca²⁺-ATPase）基因家族鉴定与表达分析,研究其家族基因间的共性与特性,为进一步揭示ACA家族进化关系提供数据支撑,为深入解析BraACAs在低温胁迫、盐胁迫以及自交不亲和方面的功能研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥ACA基因家族,同源比对出大白菜ACA基因家族,利用在线软件Expasy预测其分子量、理论等电点等理化性质;采用MEGA 5.0软件构建系统进化树;运用在线软件GSDS 2.0绘制基因结构图谱;TBtools对其染色体定位;McscanX软件进行拟南芥与大白菜ACA家族基因共线性分析;利用在线软件PlantCARE预测大白菜ACA基因家族启动子元件;通过在线工具Pfam和MEME进行蛋白保守结构域分析;利用qRT-PCR技术检测BraACAs在不同组织、非生物胁迫和自交异交授粉后的表达量。【结果】大白菜ACA基因家族有18个基因成员,分布在大白菜10条染色体上;根据进化树关系分成4组,分别包含3、4、4和7个成员;蛋白结构域分析显示,有13个成员包含N端自抑结构域。qRT-PCR结果表明,BraACAs主要在花与果荚中高表达;低温胁迫下,Bra002762与Bra035649表达量总体上调;盐胁迫下,Bra031701表达量显著上调;自交和异交授粉中,Bra003276和Bra024117差异性表达。对Bra002762、Bra035649、Bra031701、Bra003276和Bra024117亚细胞定位分析,发现这些基因均定位在细胞质膜上。【结论】大白菜ACA家族基因蛋白结构均含有4个ACA基因特有的高度保守结构域。该家族在大白菜不同组织中表达模式不同,5个ACA家族基因成员编码蛋白定位于细胞膜上,其中Bra002762、Bra035649、Bra031701与低温和盐胁迫响应有关;Bra003276和Bra024117与自交不亲和性相关。     

杨树磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族鉴定与分析

为了对已测序杨树Populus trichocarpa Torr.Gray中磷酸肌醇特异性磷脂酶C(phosphoinositidespecific phospholipase C,PI-PLC)家族基因进行系统分析,利用杨树基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定杨树PI-PLC家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过蛋白序列比对进行进化和分类分析。结果表明,杨树中含有7个PI-PLC家族基因,含有8~10个外显子,分布于杨树的4条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,杨树PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。蛋白质进化树分析结果表明PI-PLC可分为2个亚家族。     

陆地棉膜结合脂肪酸去饱和酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

膜结合脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase, FAD)是生物合成不饱和脂肪酸的关键酶。本研究以陆地棉基因组数据为基础,利用生物信息学方法对棉花FAD基因家族进行全基因组鉴定和进化分析。结果表明,陆地棉基因组中共含有37个FAD基因,进化分析发现这些基因分为4个亚家族,各亚家族成员数量不一,但相同亚家族成员含有相似的基因结构和保守基序。共线性分析发现28对复制基因全为片段复制基因,且都经历了严格的纯化选择作用。此外,在陆地棉FAD基因的启动子区域,发现了丰富的响应植物激素信号和逆境胁迫的顺式作用元件。转录组分析表明,陆地棉FAD基因家族响应干旱和盐胁迫,定量PCR分析表明施加外源褪黑素显著影响了FAD基因的表达。本研究结果为进一步解析FAD家族基因的功能奠定了基础。     

小麦TaLTR基因的克隆及初步表达分析

以小麦山融3号为试验材料,克隆了TaLTR cDNA序列(Low temperature-responsive RNA-bind-ing protein)。序列分析表明,TaLTR序列包含完整的ORF区,编码蛋白含有162个氨基酸,其氨基端包含一个RRM(RNA recognition domain)超家族保守的结构域,羧基端则富含甘氨酸;经半定量RT-PCR分析,表明TaLTR参与低温、干旱、盐胁迫逆境反应。     

小麦盐胁迫响应基因TaSRP的克隆及功能鉴定

【目的】土壤盐碱化是制约中国小麦生产的重要因素之一,耐盐性改良成为重要的育种目标。分析小麦TaSRP的功能,解析TaSRP的耐盐性作用机制。【方法】对小麦盐处理转录组测序结果进行分析,发现一个受盐胁迫诱导表达的小麦凝集素类基因TaSRP。根据TaSRP编码的氨基酸序列,通过在NCBI中比对得到水稻、大豆和拟南芥中与TaSRP相似的蛋白序列,利用DNAMAN和MEGA5.05软件进行多重序列比对和同源性分析。根据TaSRP的保守序列设计特异引物,利用TaSRP的实时荧光定量PCR检测TaSRP在不同胁迫处理条件下的表达模式;构建带有CaMV 35S启动子的16318hGFP-TaSRP绿色荧光表达载体,利用瞬时转染法将重组质粒和对照空载体导入拟南芥原生质体,室温黑暗培养16 h,激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光信号;扩增TaSRP启动子序列,利用植物顺式作用元件数据库PLACE（http: //www.dna.affrc.go.jp/PLACE）分析启动子区域中参与非生物胁迫响应的顺式作用元件;将TaSRP的cDNA序列连入带有CaMV 35S启动子的pBI121表达载体中构建pBI121-TaSRP表达载体,转入C5C81农杆菌中,采用蘸花法侵染拟南芥得到转基因株系,并进行耐盐性鉴定。【结果】TaSRP具有EUL保守区,属于卫矛凝集素（EUL）家族,定位在细胞质内。氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,TaSRP与水稻的OSR40类蛋白（OSR40g3、OSR40g2和OSR40c1）的同源性最高;与拟南芥、大豆的同源性较低。TaSRP启动子含有一系列对盐、ABA和低温等非生物胁迫响应的调控元件。实时荧光定量PCR分析显示,TaSRP受ABA和盐胁迫上调表达,对干旱胁迫无明显响应。抗性试验结果显示,在不加NaCl的条件下,野生型与过表达株系总根长基本一致,在125 mmol•L-1 NaCl和150 mmol•L-1 NaCl处理的培养基上,3个转基因拟南芥株系的总根长均大于野生型拟南芥的总根长,并达到显著性差异,表明过表达株系有较好的耐盐性,TaSRP在拟南芥中过表达能够提高拟南芥对盐胁迫的抗性。【结论】TaSRP提高了转基因拟南芥对高盐的抗性。     

小麦转录因子TabHLH041基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从小麦品种辽春10号中克隆得到1个b HLH转录因子基因Tab HLH041,并对其表达特性进行分析,以期为研究b HLH转录因子在小麦发育中的功能奠定基础。结果表明,Tab HLH041c DNA开放阅读框(ORF)长1 179 bp,编码392个氨基酸,Tab HLH041蛋白在C端含有1个b HLH结构域;该基因包括4个外显子和3个内含子。系统发育分析发现,Tab HLH041蛋白与大麦b HLH蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,总体上该基因的表达具有昼夜节律性,在光照条件下表达量呈下降趋势,在黑暗条件下表达量呈上升趋势。在低温条件下,Tab HLH041基因的表达呈现前期被诱导、后期被抑制的特征,处理24 h时低温的抑制作用最明显;在高盐、外源ABA和干旱处理条件下,Tab HLH041基因的表达持续受到抑制。综上,Tab HLH041基因可能参与光周期及逆境胁迫的信号转导途径。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

盐胁迫下调控小麦苗期性状的QTL分析

【目的】定位盐胁迫下调控小麦苗期性状的QTL位点,为分子标记辅助选择小麦耐盐性状提供基因位点和连锁标记。【方法】以小偃54×京411重组自交系群体为材料,在盐胁迫条件下检测调控小麦苗期MRL、     RDW、SDW和TDW及其相对性状的QTL位点。【结果】共检测到调控小麦苗期4个性状及其相对性状的25个QTL位点,分布在1A、2A、2D、3A、4A、4B、5B、5D、6B、7A和7B共11条染色体上,贡献率在4.4%-25.5%。其中有15个QTL位点成簇分布于3A、4A、4B、5B、5D染色体的5个遗传区间,其余10个QTL位点各自分布于不同的染色体区段。检测到的5个贡献率大于10%的位点分别位于3A染色体的Xgwm497.1-Xcfa2193和4A染色体的Xbarc78-Xgwm350.1。【结论】多数调控小麦耐盐性的QTL位点成簇分布于3A、4A、4B、5B和5D染色体上,3A染色体的Xgwm497.1-Xcfa2193和4A染色体的Xbarc78-Xgwm350.1携带所有5个贡献率在10%以上的QTL位点。     

小麦DHAR基因的克隆及生物信息学分析

以电子克隆和RT-PCR克隆获得了1个小麦脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,并对其编码的蛋白质序列进行了生物信息学分析.结果表明,该基因cDNA序列长1 187 bp,编码263个氨基酸,蛋白质分子量为28 908.2 Da,PI为6.84;具有GST-N家族和GST-C-DHAR结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族;该蛋白序列无信号肽,是亲水性蛋白,定位于细胞质叶绿体中,二级结构中以无规则卷曲(40.30％)和α螺旋(37.64％)为主,并含有少量的片层结构(17.11％);该蛋白序列与大麦、二穗短柄草、玉米、水稻、拟南芥的同源蛋白序列相似性较高,其中与大麦胞质DHAR(BAJ97007.1)蛋白进化距离最近.     

响应低磷胁迫的小麦MDP激酶基因TaMPK1a-1的克隆和表达分析

 【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶（MAP激酶）基因TaMPK1a-1为基础,开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术,鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征,采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2 170 bp,开放阅读框为1 737 bp,编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下,磷高效品种石新828和磷低效品种冀7369根叶中均检测不到TaMPK1a-1的转录本;低磷处理下,TaMPK1a-1的表达在上述品种的根叶中均受到明显诱导。与冀7369相比,低磷条件下石新828根叶中TaMPK1a-1的转录本明显增多。【结论】TaMPK1a-1级联转导途径不仅影响着小麦对低磷信号的响应,而且对于增强小麦适应低磷胁迫的能力中也可能具有重要作用。     

氮素和干旱胁迫对冬小麦幼苗生长发育及生理指标的影响

以小麦品种豫麦49-198和周麦22为材料,在水培条件下研究了氮素和干旱胁迫对小麦幼苗生长及生理指标的影响。结果表明,单一氮素和干旱胁迫均显著降低小麦株高和地上部干质量,而根干质量和根冠比升高,双重胁迫( N0+PEG)的影响最大。在2种胁迫下,根和叶片中的硝酸盐含量均显著降低,氮胁迫的影响大于干旱胁迫。叶片和根部的可溶性蛋白质和游离氨基酸含量在氮胁迫下下降,干旱胁迫下显著升高。叶片GS活性在氮胁迫下降低,但在干旱胁迫下不同基因型存在差异：豫麦49-198叶片GS活性增加,而周麦22降低。     

Cloning and Characterization of a Putative CTR1 Gene from Wheat

CTR1 is a key negative regulator in ethylene signal transduction. A salt-induced CTR1 like gene （TaCTR1） was cloned from wheat, its expression under abiotic stresses, subcellular localization and the effect of overexpression of TaCTR1 on salt tolerance in tobacco was studied. A putative CTR1 gene was cloned and characterized from wheat via rapid amplification of cDNA ends （RACE） and RT-PCR. TaCTR1 expression under stresses was analyzed using semi-quantitative RT-PCR and the effect of overexpression of TaCTR1 on salt tolerance was conducted in tobacco. The full-length cDNA of TaCTR1 is 2 635 bp which codes for a polypeptide of 759 amino acids. There is a conserved serine/threonine protein kinase domain at the carboxyl terminus containing an ATP-binding site. Southern blot analysis revealed that TaCTR1 consisted of a gene family in wheat. The amino acid homologies of CTR1 among different organisms share higher similarities. Expression analysis revealed that TaCTR1 was induced by NaC1 and drought stress but inhibited by ABA treatment. Transient expression of TaCTR1-GFP in the onion epidermal cells indicated that TaCTR1 was probably targeted to the plasma membrane. Overexpression of TaCTR1 decreased salt tolerance in transgenic tobacco （Nicotiana tabacum L.） plants compared with the control. To our knowledge, TaCTR1 is the first CTR1 gene cloned in wheat and may be involved in various abiotic stresses. Overexpression of TaCTR1 decreased the salt tolerance in tobacco suggested that TaCTR1 may act as a negative regulator of salt stress in plants.