饲料与动物产品中牛、羊源性成分的多重PCR检测

以鱼粉、奶粉、牛奶、果乳、鱼油及牛油为试验材料,进行了18S rDNA片段、牛源性成分和羊源性成分之间的多重PCR检测。多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全一致。结果表明,多重PCR方法用于进出口饲料及动物产品中牛、羊源性成分的同时检测是可行的。     

动物油脂中DNA的提取及牛、羊源性成分的PCR检测

用异硫氰酸胍法提取鱼油、加入牛肉DNA的鱼油、加入山羊肉DNA的互油和牛油中的DNA。18S rDNA片段以及牛、羊源性成分的PCR扩增结果表明，建立的动物油脂DNA提取方法是可行的。用建立的DNA提取方法提取3份送检鱼油的DNA，牛、羊源性成分的PCR检测结果均为阴性。     

浅析饲料中牛、羊源性成分的检测技术

流行病学调查证明,用患有疯牛病和羊痒病的牛、羊等动物的肉和骨头制成的肉骨粉喂养动物会导致疯牛病和羊痒病的传播,是引起疯牛病发生的最初原因。目前,用于检测饲料中牛、羊源性成分的主要方法有：以检测骨头为基础的显微镜方法;以检测蛋白质为基础的免疫学方法和以检测DNA为基础的检测方法;其它方法还包括近红外光谱法等。     

饲料中牛、羊源性成分现场可视化检测方法的建立

根据牛、羊线粒体中物种特异性序列设计引物,应用可视化环状等温扩增技术（visual loop-mediate isothermal amplification,vLAMP）对牛、羊源性成分进行快速扩增及可视化判断,同时建立牛、羊源成分人工污染的饲料模型,考察vLAMP检测方法的灵敏度。结果表明,牛源性引物和羊源性引物仅分别对牛、羊源性成分产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。本试验所建立的牛、羊源性成分现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏度,操作简单、快速,可用于饲料中牛、羊源性成分污染和食品掺伪的现场可视化检测。     

动物产品及饲料中牛源和羊源性成分三重荧光PCR检测方法的建立

为鉴定和区分饲料及动物产品中牛、山羊、绵羊源性成分,根据线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)种间保守序列,设计合成了3对特异性引物与TaqMan探针,通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了三重荧光PCR方法,在同一个荧光PCR反应中完成3种动物源性成分的检测。用该方法对16种不同源性的动物DNA进行检测,结果表明能特异地鉴别检测出牛、山羊和绵羊源性成分,且敏感性比现行国标PCR法高100倍。该方法适用于饲料、肉制品、奶制品等动物源性产品的检测。     

动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化

以牛肉、山羊肉为试验材料，对动物产品及饲料中牛源、羊源性成分PCR检测方法进行了优化。结果，牛源性成分的最低检测限可达10μg/g，羊源性成分的最低检测限达0．1μg/g。PCR检测和酶切鉴定结果表明，在水平测试的混合饲料粉中可检出牛源、羊源性成分。     

动物源性饲料中牛源和羊源性成分的检测方法

主要介绍了几种动物源性饲料中牛源和羊源性成分检测较为常用的检测法:显微组织检测法、免疫学法、近红外光谱检测法和PCR检测法以及不同检测方法的适用范围,重点介绍了PCR检测法及注意事项。     

应用多重PCR同时检测牛、羊源性成分

我们选择了3对引物A,B,C.A可扩增大多数脊椎动物(哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类)细胞色素b基因上一个371 bp的区段,B可扩增位于牛mtDNAD-loop区段内的一个274 bp的区段,C可扩增羊mtDNA基因上一个199bp的区段.由于3对引物扩增的产物分别相差约100 bp左右,可通过琼脂糖凝胶电泳分离来并观察结果,建立了基于内对照的同时检测牛、羊源性成分的三重PCR方法.     

动物蛋白饲料中动物源性成分的鉴别I．同一PCR鉴别动物蛋白饲料中牛羊成分

为了防止牛海绵状脑病(俗称疯牛病)和羊痒病传入我国，对来自疫区国家的动物源性饲料进行动物种类鉴别非常必要。本研究根据牛羊特异性卫星DNA建立了同一PCR体系同时检测羊、牛源性物质的方法。应用DNA提取液制备模板，不但有效地缩短了试验时间，还大大降低了成本，有利于在生产实际中推广应用。     

PCR detection of lentiviral GAG segment DNA in the white blood cells of sheep and goats

A PCR assay for the detection of small ruminant lentiviral gag DNA (provirus) in the white blood cells of sheep and goats was developed and compared with a serological test (AGIDT). A sample of the DNA prepared from the white blood cells in 3 ml of blood from 208 sheep and goats from 18 different flocks was subjected to PCR assay. One of 85 animals from flocks accredited under the Dutch national MVV/CAEV control programme was positive by PCR while none was positive by AGIDT. In infected flocks, the AGIDT appeared slightly more sensitive, but preliminary results show that the sensitivity of the PCR assay may be further improved by increasing the number of monocytes tested. The PCR assay, however, was clearly more sensitive in detecting animals in the early stages of infection. With the use of a set of mixed primers and probes, the assay was able to detect the variety of CAEV and MVV strains occurring in the field.     

羊肉产品中若干动物源性成分的七重PCR检测技术应用研究

试验建立了猪、牛、绵羊、山羊、鸡、马和牦牛种属鉴别的七重PCR体系,分析了牛、牦牛、山羊源性成分七重PCR检测的灵敏度,检测了10种市售羊肉产品中的动物源性成分。结果表明,采用常规的琼脂糖凝胶电泳可以区分157～517 bp的片段及相互差异在41 bp以上的多重PCR扩增产物,从而实现对这7个物种的快速及准确鉴别,其中对3个物种(牛、牦牛、山羊)DNA的检测灵敏度在2.5 ng左右;所检测的10种羊肉产品中有2种并不是包装上所宣称的羊肉,而是混杂有牛肉或完全用牛肉替代。     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

快速鉴别诊断山羊痘病毒和羊口疮病毒二联PCR方法的建立

参照GenBmk已发表的山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORF)的核苷酸序列设计了两对引物,建立了一种可以快速鉴别山羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR方法,检测结果显示,对山羊痘病毒和羊口疮病毒可以分别扩增出413 bp和595 bp的特异性片段,经敏感性测定,最低能检测到4 pg的DNA。对广西的送检的山羊病料20份进行检测,其中7份可扩增出413 bp的山羊痘特异片段、1份可扩增出595 bp的羊口疮特异片段。该方法能在4 h内完成整个检测过程,不仅快速,而且特异强、敏感性高,很适合于快速诊断。     

多重PCR同时检测猪圆环病毒2型,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

本试验建立一种可同时检测猪圆环病毒2型(PCV-2),猪细小病毒(PPV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪瘟病毒(CSFV)4种病毒的多重PCR方法.对于每一种特定的病毒,用4对寡核苷酸引物均能特异扩增其目的片段.以含有病毒目的片段的质粒为模板,测定了多重PCR的检测灵敏度,PRRSV和CSFV检测最低限是48 pg,而PPV和PCV-2为0.48 pg.利用建立的多重PCR方法对具有产自有繁殖障碍母猪的仔猪或具有呼吸障碍症状的76个仔猪样本进行检测.检出了4种病毒的存在,其中26个样本(34.2%)同时感染了2种以上病毒.结果表明多重PCR方法检测猪混合感染的病毒,是一种快速、灵敏、低成本、高效率的病原学诊断工具.     

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）基因组全序列，选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4，并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3，用引物P1／P4进行RT—PCR，然后用引物P2／P3／P4进行复合套式PCR，建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应（RT—nPCR）的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段，与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT—nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明，有15份类似CDV强毒，5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT—nPCR可以有效检测CDV感染，能够将强、弱毒株区分开，可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。     

Haematological and lymphocyte subset analyses in sheep inoculated with bovine immunodeficiency-like virus

Bovine immunodeficiency-like virus (BIV) was passagedin vivo by intraperitoneal transfusion of ovine whole blood. Prior to transfusion, the recipient sheep were given sodium thioglycolate intraperitoneally to induce mild non-suppurative inflammation. The anti-BIV antibody response, haematology, and peripheral blood lymphocyte subsets (B, , CD2⁺, CD4⁺ and CD8⁺) of recipient sheep were assessed for one year following transfusion. Passaging was successful since serum anti-BIV antibody responses were detected in 5 of the 6 recipient sheep; 1 of the 5 remained seropositive throughout the study. Lentivirus was not isolated from the recipient sheep, but provirus was detected by the polymerase chain reaction in DNA from peripheral blood leukocytes in 3 of the 5 sheep that seroconverted. In the BIV-inoculated sheep, neutrophils and eosinophils were significantly increased (p0.05) at 3 months and between 6 and 8 months postinoculation, respectively. B, CD2⁺ and CD4⁺ cells and the CD4⁺/CD8⁺ ratios were significantly increased (p0.05) 2 months postinoculation. Mild, transient haematological changes occurred in BIV-exposed sheep, but illness was not detected in the year.     

荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌方法的建立及初步应用

根据编码鼠伤寒沙门氏菌肠毒素stn基因的核苷酸序列设计1对引物和荧光探针，通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索，建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究结果显示，该方法检测沙门氏菌结果均为阳性，而非沙门氏菌均为阴性；对带有沙门氏菌肠毒素stn基因的阳性质粒的检测敏感性为4个／μL。用该方法对人工污染沙门氏菌的鲜猪肉和鲜鸡蛋进行检测，当检样中沙门氏菌初始含菌量分别为1CFU／g（鲜猪肉）和1CFU／g（鲜鸡蛋），经过12h的增菌后，检测结果均为阳性。该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点。此研究为食品中沙门氏菌快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础。