四倍体刺槐、国槐和红叶石楠对根癌农杆菌菌株及不同抗生素敏感性研究

以含有RD29A目的基因和NPTⅡ筛选基因的根癌农杆菌菌株LBA4404、GV3101和EHA105侵染饲用型四倍体刺槐(Robinia pseudoacacia)、国槐(Sophora japonica L.)和红叶石楠(Davidson Photinia)的组培苗叶片,研究3个树种对根癌农杆菌菌株和不同抗生素(替门汀和头孢霉素)的敏感性、以及根癌农杆菌菌株对3个树种的侵染能力。结果表明,不同树种、不同根癌农杆菌株和不同抗生素种类均对转化效果产生明显影响,红叶石楠是最佳受体材料,3个菌株侵染后的平均抗性愈伤率为37.0%,其次为国槐,四倍体刺槐最低;根癌农杆菌菌株LBA4404侵染能力最强,3个树种的平均抗性愈伤率达到33.3%、平均分化率达到17.6%;替门汀对农杆菌侵染后的红叶石楠组培叶片抑菌效果最好。     

抗生素对农杆菌的抑制和杨树叶片分化的影响

中嘉8号杨为湖北省林业厅和中国林科院从美洲黑杨的实生后代中选育的杨树新品系。以中嘉8号杨为材料,探讨了几种抗生素对农杆菌的抑制和对杨树离体叶片分化的影响。结果表明,噻孢霉素的抑菌效果最好,选用100~200 mg/L的噻孢霉素来抑菌是比较合适的,羧苄青霉素和链霉素对杨树叶片离体培养的毒性比噻孢霉素大,卡那霉素完全抑制芽的分化。     

碳青霉烯类抗生素抑菌效果及对植物愈伤组织影响

以2种头孢霉素类抗生素(头孢噻肟、头孢哌酮)为对照,在离体条件下(LB培养基上)检测了2种碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南)对不同农杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。同时考察了这4种抗生素对烟草和水稻愈伤组织生长的影响。结果表明,这2种碳青霉烯类抗生素的MIC和MBC均在0.2 mg.L-1以下,对于农杆菌的抑制效果要远远强于对照的头孢霉素类抗生素。而且这4种抗生素对愈伤组织生长没有明显负作用,且在一定浓度下可促进愈伤组织增殖。     

影响农杆菌介导的柑桔基因转化早期主要因素的研究

以柑桔中的枳壳，金桔，柠檬，红江橙为对象，农杆菌为载体，研究了转化早期影响效率的主要因素。结果表明：（１）抑菌用抗生素种类与浓度对不同品种柑桔上胚轴出芽率有一定影响，外植体形态学下端垂直放入培养基的放置方式比水平放置所需卡那浓度高；（２）外植体与农杆菌共培养时间３天为宜，共培养３天时各品种Ｇｕｓ阳性外植体所占比例大小依次为枳壳，金柠檬，红江橙；（３）酚类化合物的添加对Ｇｕｓ阳性率有促进作用，红江橙     

多胺物质对农杆菌介导欧美杨107遗传转化影响的研究

利用多胺对携带植物表达载体pBI121的农杆菌EHA105进行活化,之后侵染欧美杨107的叶环.GUS瞬时表达分析表明多胺活化使农杆菌的侵染效率增强,腐胺和亚精胺处理分别为对照的2.4倍和1.8倍.可见使用多胺活化农杆菌有助于提高杨树的转化率.     

沙田柚高效转化体系建立初报

以沙田柚(Citrus grandis(L)Osbeck cv．)上胚轴为对象,农杆菌为载体,进行了抗菌肽shivaA基因转入沙田柚影响因素研究。研究结果表明,沙田柚上胚轴卡那霉素选择浓度为70mg／L,抑菌用抗菌素采用羧苄青霉素效果好于其它种类抗菌素。共培养期间,50mg／L羧苄青霉素的加入可促进转化频率的提高。实生苗苗龄以20～25天为宜。预培养3天、农杆菌再悬浮液与共培养基中加入3％烟草叶片提取液、选择剂起始浓度降为50mg／L有利于转化频率的提高。     

农杆菌介导的楸树遗传转化体系

【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。     

枣组织培养中抗生素对污染的抑制作用

为解决枣组织培养中初代培养阶段外植体污染问题,以灰枣1年生嫁接苗枣头茎段为外植体,研究了4种抗生素及其不同质量浓度对灰枣组织培养中污染的抑制作用。结果表明:头孢霉素抑制效果最好,150mg/L、200mg/L质量浓度处理污染率均为0,链霉素次之,卡那霉素和青霉素G钠盐对污染的抑制效果均较差;链霉素对枣腋芽的萌发有抑制作用,培养基添加200mg/L头孢霉素时腋芽细弱,叶片黄化。因此在枣组织培养中可使用150mg/L头孢霉素来抑制污染。     

山新杨遗传转化体系的优化及转MnSOD基因植株的鉴定

为建立农杆菌介导的山新杨高效遗传转化体系,对MnSOD基因导入山新杨的遗传转化体系进行了优化,获得的较优转化体系如下:菌液浓度OD600=0.1,浸染2~5 min,共培养时加入200μmol/L乙酰丁香酮,脱菌时加入3 mg/L的AgNO3;对部分抗性植株经PCR及Northern杂交检测,证明MnSOD基因已经整合到山新杨基因组中并能够在转录水平上表达。     

抗生素及防腐剂在油茶组织培养中的抑菌效应研究

针对油茶组织培养过程中的细菌污染问题,在继代培养基中分别添加不同种类和质量浓度的抗生素和防腐剂,结果表明：（1）培养基中添加链霉素20 mg/L抑菌效果最佳,污染率为0,其次为青霉素G钠盐、青霉素G钠盐＋四环素、四环素,多粘菌素B抑菌效果最差;（2）采用苯甲酸钠、山梨酸钾作为抑菌剂,污染率均在92%以上;（3）以添加抗生素链霉素20 mg/L的培养基苗木生长状况最佳,增殖系数为3.69,叶片数为3.73,苗木生长量为2.20 cm。     

农杆菌介导CBF3基因转化扶芳藤的研究

进行扶芳藤下胚轴抗生素敏感性试验,筛选出适合其抗性芽筛选的抗生素为G418(40mg·L-1)。建立农杆菌介导的扶芳藤遗传转化体系,确定适宜农杆菌转化的菌液浓度(OD600)、浸染时间(min)和共培养时间(hr)分别为:0.5、30和48。     

国槐遗传转化体系的优化

采用根癌农杆菌介导的国槐叶盘转化法,在建立修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)转化体系过程中,对影响农杆菌转化频率的各种因素进行研究.结果表明:国槐叶片需在黑暗条件下在MS培养基上预培养5天,农杆菌菌株选用GV3101,农杆菌共培养3天较合适;农杆菌菌液浓度OD600约为0.7,感染时间10 min;侵染前的菌液和共培养基中添加200/μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)对国槐遗传转化有明显的促进作用;抑制农杆菌生长的抗生素浓度以头孢霉素(Cef)500mg·L-1最好.PCR和Southern blotting检测证实sck基因已整合到国槐基因组中.     

利用农杆菌介导法获得转codA基因麻竹再生植株的研究

温度是影响植物生存和生长发育的基本环境因子之一。大多数植物对低温等都是高度敏感的,低温伤害现象尤为突出,几乎涉及所有的经济植物。因此,改善植物的抗低温冻害的胁迫能力,可以显著提高植物的生长范围、增加产量。codA基因可以增加植物对低温胁迫的耐受能力,而Rd29A是一种胁迫诱导特异表达启动子,胁迫条件可以快速诱导基因表达,也可以减少由于转基因过量表达带来的不利影响。研究以麻竹花药离体培养的愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法,探讨了影响麻竹愈伤组织遗传转化效率的主要因子。结果表明,潮霉素的最佳筛选浓度是25 mg.L-1,预培养时间为3 d,侵染时间为20 min,共培养时间为3 d,乙酰丁香酮的浓度控制在100 mg.L-1时可以有效的提高遗传转化效率。在此基础上对获得的转基因植株进行分子检测,初步表明外源基因codA已经整合到麻竹基因组中。     

尾赤桉DH201-2遗传转化体系建立的研究

以建立的尾赤桉(Eucalyptus urophylla × E. camaldulensis)DH201-2无性系高频再生体系为基础,利用GUS染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、农杆菌预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对尾赤桉茎段和叶片外植体遗传转化的影响,探讨了适宜尾赤桉转化的卡那霉素和抑菌抗生素头孢塞污钠的使用浓度.结果表明,较优的转化条件是:采用农杆菌菌株GV3101,以茎段为受体材料,经过预培养6 d,在光密度OD600=0.5的菌液中浸泡30 min,然后转移到共培养培养基中共培养4 d,再转移到含90 mg/L卡那霉素和300 mg/L头孢噻肟钠的筛选培养基上,进行转化植株的再生,同时在共培养培养基和菌液中添加100 μM的乙酰丁香酮能够提高茎段外植体的转化效率.     

农杆菌介导转化石斛兰—蝴蝶兰杂交种类原球茎体的研究

以类原球茎体为受体材料,利用农杆菌EHA101(pIG121 Hm)介导转移GUS基因到石斛兰-蝴蝶兰的2个杂交品种。以一种β-内酰胺类新型抗生素美罗培南(Meropenem)作为抑菌抗生素和以潮霉素为筛选元件进行选择,获得了潮霉素抗性体,并通过X-gluc组织化学染色法,检测到较强的GUS的表达,表达率达80%以上。经过80 d的选择培养后在81个潮霉素抗性组织中获得了22株再生兰花。对其中的9株PCR阳性的再生植株进行Northern分析,检测到较强的GUS基因表达。     

农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系

【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。     

肉桂精油和肉桂醛的抑菌、抗氧化和酪氨酸酶抑制活性研究

以肉桂精油和肉桂醛为研究对象，采用滤纸片法、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）法，研究二者对4种细菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌）和1种真菌（白色念珠菌）的抑菌效果；采用2,2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺）阳离子自由基（ABTS⁺·）清除能力和铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）,抑制酪氨酸酶活性的方法，对比二者的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性。研究结果显示：二者对5种供试菌种抑制效果表现出不同敏感性，均对白色念珠菌的抑制效果最佳；综合MIC和MBC结果可知二者对供试菌种的抑制效果具有差异性，其中肉桂醛对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和绿脓杆菌抑制效果明显优于肉桂精油。肉桂精油抗氧化活性优于肉桂醛，16 g/L肉桂精油的ABTS⁺·清除率为94.1%,是肉桂醛的3倍，FRAP值为1 502μmol/L,是肉桂醛的5.8倍。肉桂精油和肉桂醛均能显著抑制酪氨酸酶活性，肉桂精油对酪氨酸酶的半数抑制质量浓度(IC₅₀)为4.02 g/L,而肉桂醛对酪氨酸酶的IC₅₀小于1....     

红松不同部位精油的成分分析及抑菌活性

【目的】植物精油是安全并有良好抑菌效果的天然产物,在食品防腐剂领域潜力巨大。本研究通过对红松不同部位精油成分与抑菌活性的研究,能为开发安全绿色的食品防腐剂及为其在食品、化妆品等领域的应用提供理论基础。【方法】采用水蒸气蒸馏法从红松的松针、松塔、松壳中制备精油,采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术结合保留指数(RI)分析法,对精油化学成分组成进行鉴定。采用滤纸片法分析比较了3种精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌活性,并用二倍稀释法测定对3种菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。【结果】松针、松塔、松壳精油分别检测出28、46、21种成分,其中松针和松塔精油以萜类为主,而松壳精油以酮类为主。3种不同部位的精油对大肠杆菌抑制效果更佳,但松针精油的抑制效果比其他两种抑制效果更强。松针精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为1.6、3.2、6.4μL/mL,最小杀菌浓度为3.2、6.4、12.5μL/mL;松塔精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为3.2、6.4、6.4μL/mL,最小杀菌浓度为6.4、12.5、12.5μL/mL;松壳精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为3.2、12.5、6.4μL/mL,最小杀菌浓度为6.4、12.5、6.4μL/mL。【结论】红松不同部位的精油均具有较好的抑菌效果,而且红松不同部位精油的成分不同其抑菌效果亦不同,作为天然的抑菌剂资源具有巨大的开发利用价值。     

抗生素对刺槐组织培养丛生芽分化的影响

四倍体刺槐是我国从韩国引进的新品种,具有速生、枝密、叶大等特点,有一定的抗旱、耐盐、耐贫瘠、抗风沙能力。由于引进的刺槐繁殖材料少,抗病虫害能力低,因此在短时间内采用组织培养技术进行快速繁殖的基础上对其抗病害的转基因工程研究是必要的。本实验即对刺槐组织培养丛生芽分化对抗生素的敏感性展开研究,并结合抗生素对农杆菌的抑菌效果,确定农杆菌介导的刺槐转基因工作中的最佳抗生素为头孢菌素,其最佳使用浓度为200mg／L,为下一步转基因工作奠定基础。     

影响小桐子叶片诱导不定芽分化主要因素的研究

以MS为基本培养基,通过正交试验,探讨BA浓度、NAA浓度、暗培养时间以及AgNO3浓度对小桐子叶片诱导不定芽的影响,筛选出最佳诱导小桐子叶片不定芽分化的培养基为MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+暗培养14 d+0 mg/L AgNO3.