迟钝爱德华菌鞭毛基因克隆表达及其免疫学活性分析

从鳗源迟钝爱德华菌Edwardsiella tarda菌株ETY的基因组克隆到其鞭毛基因(flagella gene,ETF)。该基因开放阅读框为1 257bp,编码419个氨基酸,推导的蛋白分子量为43.951kD。ELISA和Western-blotting试验证实表达的蛋白与迟钝爱德华菌菌株ETY表达的鞭毛蛋白具有相同的抗原性和免疫原性。免疫攻毒保护试验证明:经表达产物(ETF-rxA融合蛋白)与ISA佐剂结合免疫的日本鳗鲡对爱德华菌ETY的免疫保护率可达到100%。本试验首次成功实现了ETF基因的高效表达,并初步证实了迟钝爱德华菌鞭毛可诱导产生免疫保护,为进一步研制合适的高效的迟钝爱德华菌鞭毛亚单位疫苗奠定了基础。     

马链球菌马亚种新疆株ZX表面蛋白的提取及免疫原性分析

为研究马链球菌马亚种新疆分离株 ZX 表面蛋白的免疫原性,用化学法提取该菌的表面蛋白,用 SDSG PAGE检测提取的表面蛋白,并将提取的表面蛋白与该菌免疫实验兔后产生的抗体及康复马血清反应,利用 WestG ernGblotting和 ELISA试验分析其免疫原性.结果表明,SDSGPAGE电泳可检测到分子量为45,34,33,30,27,20,16 kDa 7条主蛋白带.提取的7条蛋白带多数可与全菌免疫兔的抗体及康复马体内的抗体发生特异性的结合.用提取蛋白和全菌包被 ELISA对马血清的检测表明,二者的阳性吻合率在86．0％.表明提取的表面蛋白具有理想的免疫原性.     

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

创伤弧菌外膜蛋白的分离及其抗原性分析

分别采用Sarkosyl和PMSF法分离、提取鳗源创伤弧菌FJ03-X2的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE和Western-blotting分析比较两种方法提取的外膜蛋白的组分和抗原性。SDS-PAGE分析结果表明,Sarkosyl法分离的主要外膜蛋白分子量集中在14～66 kDa之间;而PMSF法分离的主要外膜蛋白分子量分布在14～92 kDa之间。在两种方法中,分子量38 kDa、36 kDa的外膜蛋白均为高丰度蛋白。两种方法提取的创伤弧菌外膜蛋白经SDS-PAGE后,用兔抗创伤弧菌FJ03-X2血清进行Western-blotting,结果显示,兔抗FJ03-X2高免血清能识别绝大多数外膜蛋白组分,说明FJ03-X2菌株的外膜蛋白具有良好的抗原性。其中,分子量分别为66kDa、47 kDa、44 kDa、38 kDa、36 kDa、34 kDa的外膜蛋白呈强阳性反应,是主要的免疫原组分。同时,经比较分析认为PMSF法提取创伤弧菌外膜蛋白的效果更好。     

地图鱼迟钝爱德华氏菌病病原菌的鉴定及毒力基因的检测

从患病地图鱼Astronotus ocellatus肝脏组织中分离到菌株AO1,经人工感染试验证实其为致病菌。通过ATB Expression半自动细菌鉴定仪和常规生理生化特性的分析,初步鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌Ed-wardsiella tarda。测定菌株AO1的16S rRNA基因序列并进行分析,结果显示,该菌株与迟钝爱德华氏菌的同源性最高,达99.9%。因此,可鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌。根据迟钝爱德华氏菌的毒力基因菌毛亚基(fimA)基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到383 bp序列,该序列与迟钝爱德华氏菌的fimA基因序列相似性达99.0%,进一步说明菌株AO1具有fimA基因,有一定的致病力。药物敏感试验结果表明,菌株AO1对阿米卡星、氧氟沙星、庆大霉素、新生霉素、氨苄西林、氨曲南、卡那霉素、头孢咪啉、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、妥布霉素、氨苄青霉素13种抗生素较为敏感。     

猪链球菌荚膜多糖抗血清的制备及在血清分型中的应用

为获得猪链球菌荚膜多糖及其抗血清,采用高压破碎法、乙醇分级沉淀法、酶解法以及Sevage法提取纯化了猪链球菌2、3、7、9型荚膜多糖,采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法将荚膜多糖与牛血清蛋白(BSA)偶联,将其制备成油乳疫苗免疫BALB/c纯系雌性小鼠制备抗血清,同时制备了猪链球菌2、3、7、9型全菌灭活苗抗血清进行了间接ELISA试验及玻片试验检测。试验结果显示,制备了高纯度的荚膜多糖,对荚膜多糖-牛血清白蛋白偶联物分析,荚膜多糖偶联蛋白后的分子量变大,荚膜多糖与牛血清白蛋白偶联比为1∶1,免疫小鼠表现出较高的免疫原性。而将单独的4种荚膜多糖以及荚膜多糖与牛血清白蛋白(牛血清白蛋白)混合作为比较也免疫小鼠不能激活免疫系统产生IgG抗体,不具有免疫原性。荚膜多糖结合蛋白抗血清与全菌灭活苗抗血清同时进行交叉ELISA以及玻片凝集试验,结果表明这4型荚膜多糖结合蛋白抗血清不与其他型菌株发生反应,具有型特异性,而全菌灭活苗抗血清与其他型菌株会发生一定程度的交叉反应。此研究结果为猪链球菌亚单位疫苗的研制以及猪链球菌分型试剂的制备提供了试验依据。     

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda L-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况.结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank 中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99％、97％、99％、99％、99％、98％;通过优化反应条件,在退火温度为54 ℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因.表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株.     

迟钝爱德华氏菌的分离鉴定及体外抑菌效果研究

从患病金鳟体内分离得到一株菌株,经16S rRNA定为迟钝爱德华菌,并对其进行体外抑菌实验研究.采用水提法、水浸法、醇提法、超声醇提法4种方法制备大黄和五倍子中药原液,并用滤纸片法和二倍稀释法测定其对迟钝爱德华氏菌的体外抑菌活性.结果表明,五倍子和大黄对迟钝爱德华氏菌均有抑菌活性,五倍子抑菌效果优于大黄.五倍子以醇提法的抑菌效果最好,其抑菌圈直径为22.617±1.493 mm,最小抑菌浓度(MIC)为7.8125 mg/mL;大黄以超声醇提法抑菌效果最好,其抑菌圈直径为(12.193±0.688)mm,最小抑菌浓度(MIC)为125 mg/mL.结论:大黄和五倍子对迟钝爱德华氏菌有抑菌作用,五倍子抑菌效果优于大黄.     

养殖黄颡鱼腹水症病原研究

对近年来黄颡鱼养殖过程中暴发的腹水症的病原进行了研究.病鱼症状主要为游动迟缓,体表、肝脏充血,积有腹水,后期伴有皮肤溃烂等,采用光镜及透射电镜超薄切片观察,生理生化指标鉴定及16S rDNA同源性分析及系统发育树构建等方法,对从多处组织中分离获得的病原菌进行了鉴定:其形态特征及生理生化指标符合迟钝爱德华氏菌特点,GenBank中同源序列检索结果显示,该菌与迟钝爱德华氏菌的16S rDNA序列同源性高达99%,系统进化树中与迟钝爱德华氏菌自然聚为一支.     

鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1融合基因的原核表达

目前在针对鱼类神经坏死病毒的疫苗研究中,主要是将神经坏死病毒某些蛋白作为抗原进行注射免疫,但是传统的注射免疫并不能有效地激发黏膜免疫。笔者将鱼类神经坏死病毒的衣壳蛋白（MCP）与鮰爱德华氏菌的跨粘膜蛋白ompN1融合表达,拟制备能够抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗;利用从NCBI GenBank库里获得的鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌的外膜蛋白ompN1的基因序列,将两者进行序列优化与全基因合成,分别构建原核表达载体:MCP-ompN1 pET28a和MCP pET28a和ompN1 pET28a,并在大肠杆菌内分别诱导表达融合蛋白MCP-ompN1,MCP,ompN1后,再利用包涵体纯化及透析复性获得MCP-ompN1,MCP,ompN1蛋白。SDS-PAGE结果显示,原核表达纯化得到了较纯的MCP-ompN1 融合蛋白,Western Blotting结果表明,纯化得到的MCP-ompN1 融合蛋白不仅具有MCP抗原性,还具有ompN1抗原性。本实验通过原核表达纯化得到了鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1的融合蛋白MCP-ompN1,为进一步验证融合蛋白MCP-ompN1能否作为抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗奠定了基础。     

犬血清IgG的纯化、抗体制备及其鉴定

[目的]探讨犬血清IgG的纯化方法。[方法]采用硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析提取纯化犬血清IgG,利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法鉴定所得产品的纯度和免疫活性。[结果]获得的纯化犬血清IgG的SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的犬血清IgG;重链分子量为58kD,轻链分子量为27kD,IgG分子量为170kD。特异性检测发现犬血清IgG重链和轻链都能与鼠抗犬血清IgG抗体结合,表明纯化犬血清IgG具有免疫原性和反应原性。[结论]硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析可获得纯度高、活性好的纯化犬血清IgG,为犬血清IgG相关的免疫学试验提供了高质量的免疫材料。     

羊附红细胞体抗原的分析及初步应用

将提取的羊附红细胞体抗原进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析,并以此抗原为诊断抗原,用ELISA方法对64份羊的血清样本进行了初步检测。结果表明,56kDa和26kDa的羊附红细胞体抗原具有较好的免疫性,而且不与羊附红细胞体阴性血清和羊支原体病阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;ELISA检测的64份血清样本的阳性率为66.7%,比涂片镜检高22.9个百分点。     

猪带绦虫TSOL18-SP蛋白的原核表达及其多抗的制备

对TSOL18基因中4个碱基进行定点突变,并截去N端16个氨基酸的信号肽,构建pGEX-TSOL18-SP原核表达载体,IPTG诱导表达后进行产物的SDS-PAGE及Western blot分析;用改造的纯化蛋白免疫家兔后采集血清,经琼脂双扩散试验检测血清抗体效价.结果表明:TSOL18基因改造后长度为345 bp,共有7个碱基发生突变,但氨基酸序列没有改变,与GenBank收录的TSOL18基因核苷酸序列相似性为97%,氨基酸序列相似性为100%.SDS-PAGE及Western blot分析表明:改造的重组菌诱导后可高效表达可溶性目的蛋白,且TSOL18-SP分子量约为38.7 kD,与猪带绦虫六钩蚴阳性血清反应性强;琼脂双扩散法测定免疫兔血清抗体效价为1∶32~64,说明表达的TSOL18-SP蛋白具有较好的免疫原性.     

嗜水气单胞菌ZN1株Mah-TrxA融合蛋白的粘附功能分析

为深入探讨嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)主要粘附素在菌体侵入宿主和介导宿主产生免疫过程可能扮演的角色,对Ah菌ZN1株主要粘附素重组基因的表达产物的部分生物学功能进行分析。通过酶联免疫吸附试验、细胞与Ah菌的粘附试验及粘附抑制和阻断试验,研究分析克隆表达的Mah-TrxA(硫氧还蛋白与主要粘附素形成的融合蛋白)生物学功能。结果显示:克隆表达的Mah-TrxA融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,对不同Ah菌株有交叉粘附抑制的作用,抗原竞争性抑制试验和抗体阻断试验均能显著减少不同Ah菌株对EPC的粘附作用。因此,克隆表达的Mah-TrxA确为ZN1菌株的主要粘附素;基因工程技术以融合蛋白形式表达的Mah-TrxA与野生菌株ZN1表达的主要粘附素具有类似的生物学活性。     

新城疫病毒F48E9株HN蛋白抗原结构域区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒F48E9株的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定172～570位氨基酸区域作为多肽表位候选区域。以pUC18-F-HN为模板,设计引物通过PCR扩增,获得HN抗原结构域基因片段,SaⅠl、NoⅠt双酶切定向克隆到原核表达载体pET28a,获得重组质粒分别命名为pET28a-HNa。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HN抗原结构域基因片段获得了融合表达,Western-blotting分析证实表达产物HN与NDV阳性血清具有免疫反应性。为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白相互作用奠定了基础。     

四种方法对鲢血清免疫球蛋白的纯化及分子量测定

采用mannan-binding protein(MBP)、TG及免疫亲和层析法和饱和硫酸铵沉淀法纯化鲢血清免疫球蛋白IgM,并比较了4种纯化方法的纯化效果.SDS-PAGE显示鲢血清免疫球蛋白的重链和轻链分子量分别为76.4 kD和27.2 kD,推算其总分子量约828.8kD     

O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达(英文)

According to the complete genome of foot-and-mouth disease virus(FMDV)type O,a pair of special primers was designed to amplify VP1 gene.The VP1 gene was amplified by RT-PCR and subsequently inserted into the expression vector pGEX-6p-1 and induced by IPTG.Then SDS-PAGE showed the expressed protein was 51 kD in molecular weight.Then the product was purified by GSTrap FF columns.The product was detected through Western-blot that showed the protein has antigenicity.It provided fundamental data and materials for further investigation on diagnosis method of FMDV.     

鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因生物信息学分析及其原核表达

[目的]了解鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因分子生物学特性,确定其编码蛋白抗原性,为鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗研发提供新的靶标抗原选择.[方法]采用PCR克隆鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因,以DNASTAR和NCBI数据库分别进行基因生物信息学分析;利用pCold-TF原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并分别以SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达形式及其抗原特异性.[结果]从鸭疫里默氏杆菌基因组扩增获得的AS87-01740基因编码框全长618 bp,编码205个氨基酸,理论分子量约21.87 kD,理论等电点(pI)8.2,正电荷氨基酸总数17个,负电荷氨基酸总数16个.AS87-01740蛋白序列在同种属分离株中,与2型血清型分离株(11845、YM、GD和CH-2)有很高的相似性(>99%),与1型血清型分离株(CH-1和CH-3)的相似性为92%;在不同种属中,与金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、动物溃疡伯格菌(Bergeyella zoohelcum)和脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabeth-kingia meningosepticum)的相似性分别为61%、60%和57%.经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得的融合蛋白分子量约77 kD,以可溶性表达形式为主.Western blotting检测结果表明,融合蛋白能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生特异性免疫反应.[结论]AS87-01740基因编码蛋白在不同鸭疫里默氏杆菌分离株中具有很高的保守性,且能与其阳性血清发生特异性免疫反应,是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原.     

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。