原核表达牦牛朊蛋白的纯化及其活性测定

以原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备抗牦牛朊蛋白的特异性抗血清。经Western blotting和间接ELISA鉴定,该抗血清可与牦牛重组成熟PrP(23～242)和牛脑组织提取物发生反应,蛋白酶K消化各抗原可消除免疫反应,但不与GST蛋白和E.coli BL21(DE3)的菌体蛋白发生反应,表明该抗血清为抗牦牛重组成熟PrP(23～242)的抗血清,其效价高达1∶12800,并能识别黄牛脑组织中的天然朊蛋白。原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白能有效地刺激免疫动物产生PrP特异性抗体,所制备的抗血清可适用于天然朊蛋白的检测。     

猪日本乙型脑炎病毒NS5原核表达和多克隆抗体制备

提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.     

C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

以经典毒株C株的基因组为模板,测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析,并对抗原表位进行预测,结果表明NS3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物,分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因,分别用pET-28a表达载体进行重组后,获得pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达,b段表达较高,可溶性表达较好,纯化后,可获得重组蛋白CSFV-His-NS3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性,并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强,可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

交替氧化酶的原核表达、纯化及活性研究

利用原核表达系统BL21和FN102表达交替氧化酶,用镍-NTA(Ni-NTA)琼脂糖凝胶层析柱纯化交替氧化酶可溶蛋白,利用SDS-PAGE检测纯化蛋白电泳纯度,用分光光度法测蛋白活性.结果表明:FN102表达的交替氧化酶量高于BL21;在BL21表达系统中的蛋白电泳纯度＜10％,而在FN102中表达的纯化蛋白电泳纯度达到90％～95％;BL21中表达交替氧化酶纯化蛋白活性为165.1 nmol/(min· mg),FN102中表达的交替氧化酶纯化蛋白活性为64.0 nmol/(min·mg).     

新型Resilin-R5融合蛋白的大肠杆菌表达和纯化

为了获得兼具"高弹性"和"硅沉积"性能的新型功能生物材料,将具有高弹性的Resilin蛋白与具有硅沉积作用的R5肽进行了融合,研究其在大肠杆菌中的表达,建立了简易的纯化方法。首先,将果蝇弹性蛋白基因CG15920序列与硅藻R5肽基因序列进行拼接,经过稀有密码子优化后合成重组基因resilin-r5。然后将其插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得表达菌株,并通过IPTG进行诱导表达。最后以盐析加热法和Ni离子柱亲和层析法纯化带组氨酸标签的重组融合蛋白。最终实现Resilin-R5融合蛋白的高效表达,产量达到120 mg·L-1发酵液,为"高弹性-硅沉积"融合蛋白Resilin-R5的性能表征和创新应用奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在E.coli中的表达

选择一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(简写为GD/1/96),根据测得的NS基因序列,设计一对特异性引物NS1U/NS1L,RT-PCR方法扩增该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体PET-32a( ),并进一步酶切分析和序列测定,鉴定出NS1基因的阳性重组子。阳性质粒转化E.coliBL 21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,成功的在细菌包涵体中表达出45 kD的NS1融合蛋白。重组蛋白经Ni-NTA His.Bind Resins纯化。     

水稻抗白叶枯病基因 xa5的原核表达及蛋白纯化

水稻是重要的粮食作物,其产量高低与病虫害等因素密切相关,由黄单胞杆菌引起的水稻白叶枯病是导致水稻产量减少的主要病害之一。控制白叶枯病最安全、经济有效的方法是培育抗病品种,隐性抗病基因xa5是重要的水稻白叶枯病抗性基因。通过构建显性及隐性xa5基因的原核表达载体(PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5),转化大肠杆菌BL21,经0.2 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h,表达显性Xa5和隐性xa5蛋白;结合western-blotting分析,结果表明表达的蛋白是带有GST标签的融合蛋白,最后利用谷胱甘肽亲和层析柱将蛋白纯化,为后期研究xa5基因的功能提供基础。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

持续表达HCV NS5B的Bel-7402细胞系的构建与鉴定

HCV NS5B是HCV复制所必需的RNA依赖的RNA聚合酶和抗HCV药物的一个理想靶标,构建持续表达NS5B的肝细胞系将有助于研究HCV在肝细胞的复制机制和抗HCV药物的研发.ScaI酶切含有NS5B基因的重组表达载体pcDNA-5B,获得的线性化pcDNA-5B通过脂质体转染人肝癌细胞系Bel-7402细胞,G418筛选转染细胞.阳性细胞经基因组PCR、RT-PCR和Western Blot鉴定,证实获得持续表达NS5B的Bel-7402细胞系.体外复制试验和荧光索酶试验表明:Bel-7402细胞表达的NSSB蛋白有体外和细胞内RNA依赖的PNA聚合酶活性.持续表达有聚合酶活性的HCV NS5B的Bel-7402细胞系的建立为进一步研究NS5B催化的HCV复制机制和NS5B抑制剂的筛选奠定基础.     

丙型肝炎病毒NS4B蛋白调控Hep3B细胞非折叠蛋白质反应研究

研究表达的丙型肝炎病毒(HCV)NS4B对Hep3B细胞非折叠蛋白质反应的影响。NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染Hep3B细胞,G418筛选和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内XBP1 mRNA剪接,Western blot鉴定ATF6蛋白切割,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78和XBP1启动子活性。G418筛选和Western Blot鉴定证实获得稳定表达NS4B的Hep3B细胞;在该细胞内,XBP1 mRNA剪接、ATF6切割、XBP1和Grp78启动子激活均被检测到。NS4B在Hep3B的稳定表达诱导了非折叠蛋白质反应。     

唾液富组蛋白5的原核表达、纯化与抗菌活性鉴定

设计一对3’端互补、5’端带酶切位点的引物,用PCR扩增唾液富组蛋白5(H5)基因(h5),将我体pGEX4T-2和h5双酶切、连接、转化DH5α,将筛选鉴定的重组质粒pGEX4T-2-h5转化BL21 (DE3).诱导重组菌BL21 (DE3) -pGEX4T-2-h5表达,纯化融合蛋白GST-H5,用Thrombin切去GST标签获取重组H5(rH5),测试rH5抗白色念珠菌(Candida albicans)活性.试验成功构建了重组载体pGEX4T-2-h5,在37℃重组菌BL21 (DE3)-pGEX4T-2-h5生长至OD600nm=0.6时用1 mmol/L IPTG于20℃诱导9h,可获得高水平表达的融合蛋白GST-H5;酶切后获得的rH5对白色念珠菌生长有较强的抑制作用,rH 5产率约2 mg/L.     

大鼠甘油醛3 磷酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活动态监测

利用大肠杆菌原核表达系统高效表达大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,并结合蛋白分离纯化技术获得高纯度样品,动态监测其酶活。通过RT-PCR技术,扩增PC12细胞中甘油醛3-磷酸脱氢酶编码序列并亚克隆到原核表达载体pET28b;鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞并采用诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达,表达产物采用15% SDS-PAGE鉴定,用镍柱对蛋白进行纯化及脱盐;最后将分离纯化产物在体外进行甘油醛3-磷酸脱氢酶酶活动态分析。结果表明,成功构建大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶的原核表达载体pET28b-G3PDH;高效表达甘油醛3-磷酸脱氢酶,表达产物占总蛋白35%,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清;制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活动态扫描显示其具有高效酶活性。通过大肠杆菌原核表达技术高效制备具有重要酶活作用的大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,为进一步研究其在糖代谢中的功能以及其可能的新功能奠定基础。     

志贺毒素B(ShT-B)亚单位基因的克隆、表达与纯化

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEM—TB3克隆质粒，得到为225bp成熟ShT—B基因片段，将其插入到经同样双酶切的pQE30表达载体中，构建了ShT—B的重组表达质粒pQE30-B2，转化到E．coli M15，经IPTG诱导后，重组质粒目的蛋白均得到表达表达蛋白约占菌体总蛋白的16％，主要为可溶性形式，约9．2％。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。     

猪圆环病毒2型ORF5编码非结构蛋白的表达

【目的】探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)中ORF5所编码非结构蛋白(NS)的功能。【方法】根据Gen-Bank已发表PCV-2基因组序列设计特异引物,分别以HZ0201株(AY188355)、美国98-15237株病毒DNA为模板,采用PCR法扩增PCV-2ORF5基因,并构建了pGEX-4T-1-ORF5原核表达载体和pEGFP-C2-ORF5真核表达载体,对ORF5重组蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western blot分析,用真核表达载体pEGFP-C2-ORF5转染PCV-2易感细胞PK-15。【结果】PCV-2ORF5基因长162bp,编码54个氨基酸;其所编码蛋白在E.coli中以包涵体形式存在,分子质量大小约为32ku。【结论】PCV-2ORF5编码重组蛋白在真核PK-15细胞中成功表达。     

抗自溶烟草蚀纹病毒蛋白酶的原核表达和纯化及活性分析

利用QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit将自溶性烟草蚀纹病毒蛋白酶（tobacco etch virus Protease,TEVP）219位的Ser（S）突变为Val（V）,经测序验证的S219V突变质粒pMAL TEVPS219V电转化大肠杆菌BL21 Star（DE3）,并优化异丙基硫代β D半乳糖苷（IPTG）诱导浓度、温度、时间对TEVP表达的影响。结果表明,突变的TEVP 表达最适条件为24 ℃,0.75 mmol/L IPTG诱导11 h。经金属离子螯合层析纯化得到高纯度,高活性的突变TEVP蛋白酶,比活力为1 048 U/mg。每升菌液可纯化17.2 mg目标蛋白。     

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子(Q-Sepharose)交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽(signal peptide)、几丁质结合域(chitin binding peritrophin-A,Ch BD)、A型低密度脂蛋白受体结构域(low-density lipoprotein receptor class A,LDLa)和脱乙酰基酶催化结构域(catalytic domain,CDA)。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间(67—84 aa)的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸(84—106 aa)之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL~(-1),并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。     

Secretive Expression of Insect Antifungal Peptide-Encoded Genes in Pichia pastoris and Activity Assay of the Products

The antifungal peptides, drosomycin （Drs） and its isoform drosomycin-like C （Drs-lC） from Drosophila melanogaster and Thanatin from Podisus maculiventris, have potent activity with broad spectrum against filamentous fungi. Secretive expression of these genes in yeasts makes it possible to utilize the supernatants of yeast culture as protective reagents on fruit, vegetable, food and other agricultural products. So the study of effective secretion by yeast expression system is of great importance. Three genes, Drs, Drs-lC, and Thanatin, were cloned into pPICZαA and the recombinant vectors, pPICZαA-Drs, pPICZαA-Drs-lC, and pPICZαA-Thanatin were transformed into Pichia pastoris by the electric transfer method. The recombinant P. pastoris, which was screened by phenotype selection and PCR amplification, was induced to express antifungal peptide by methanol. The expressive products of the three recombinants showed antifungal activity against 5 out of 6 test fungi strains, and the products of Thanatin also had strong activity against the tested bacteria. The three antifungal peptide genes, Drs, Drs-lC, and Thanatin, were constructed into yeast P. pastoris. The expressed peptides were successfully secreted into the culture medium and exhibited potent activities against the test strains.     

昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定

 【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin (Drs)及其同系物Drosomycin-like C (Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达，对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因（Drs）及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组，构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZαA-Drs-lC和pPICZαA–Thanatin。利用电转化将重组质粒转化毕赤酵母GS115，经表型筛选和PCR鉴定获得的重组毕赤酵母转化子，在甲醇诱导下进行抗真菌肽的分泌表达。【结果】3种抗真菌肽基因的酵母表达产物对6个供试真菌中的5个有明显的抑制作用，Thanatin同时对供试细菌有抗菌活性。【结论】Drs、Drs-lC和Thanatin抗真菌肽基因成功地转化毕赤酵母，并实现其分泌型表达。