甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种浙双758子叶柄外植体为受体,建立农杆菌介导转化体系,研究乙酰丁香酮、羧苄青霉素浓度和潮霉素筛选浓度等对农杆菌遗传转化效果的影响。结果发现,羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以500mg/L最佳,且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最小,愈伤组织诱导率和芽再生率分别为75.2%和65.1%。5.0mg/L的潮霉素能完全抑制未转化再生植株的生长,使其最终褐化死亡,在此潮霉素筛选浓度下,获得了32株转化再生植株。共培养时培养基中添加100μmol/L AS的芽再生率为3.9%,显著高于未添加AS的芽再生率（2.0%）,说明共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体T-DNA的转化。部分转化再生植株经PCR和Southern杂交检测呈阳性,病虫害接种试验表明转化植株对菌核病和小菜蛾有较好的抗性。     

抗生素对高粱茎尖再生的影响及再生体系的建立

研究羧苄青霉素、头孢霉素、潮霉素和卡那霉素4种抗生素对高粱茎尖再生的影响及再生体系的建立结果表明,MS培养基中添加甘氨酸、乙二胺四乙酸的铁络合物(Fe-EDTA)和抗坏血酸等有机物有利于高粱茎尖的分化与生长。农杆菌介导的高粱茎尖遗传转化过程中羧苄青霉素为最理想抗生素,最佳浓度为250mg／L。并初步确立了高粱茎尖农杆菌介导的遗传转化过程中抑菌和转化体的筛选策略。     

抗生素对高粱茎尖再生的影响及再生体系的建立

研究羧苄青霉素、头孢霉素、潮霉素和卡那霉素4种抗生素对高粱茎尖再生的影响及再生体系的建立结果表明,MS培养基中添加甘氨酸、乙二胺四乙酸的铁络合物(Fe EDTA)和抗坏血酸等有机物有利于高粱茎尖的分化与生长。农杆菌介导的高粱茎尖遗传转化过程中羧苄青霉素为最理想抗生素,最佳浓度为2 5 0mg/ L。并初步确立了高粱茎尖农杆菌介导的遗传转化过程中抑菌和转化体的筛选策略     

农杆菌浸种法介导中华结缕草遗传转化体系的建立

以中华结缕草萌动种子为转化受体,利用NPT-Ⅱ筛选基因对影响农杆菌介导的遗传转化外部因素进行探索,通过优化转化条件,建立了农杆菌浸种途径介导的中华结缕草遗传转化体系。结果表明：利用催芽6-7d的种子,加入OD600值为0.9的农杆菌浸染菌液（在浸染菌液中添加100μmol.L-1乙酰丁香酮）,附加5min+30s真空处理,振荡浸染48h,共培养3d后,用75mg.L-1卡那霉素筛选能够获得较好的转化效果。通过对卡那霉素抗性苗进行PCR检测和GUS组织化学染色,初步验证NPT-Ⅱ和GUS基因已经整合进植物基因组,阳性转化率为55.21%。     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响。结果表明,选择无菌苗苗龄15d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3~0.6,侵染时间8min,侵染时菌体重悬液中添加50μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3d,抗性芽的获得率最高。对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性。     

正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立

本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、菌液浓度、AS浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素(Kanamycin)的适宜浓度。结果表明:外植体预培养7d,在含乙酰丁香酮AS200μmol/L、菌液浓度OD值为0.6的农杆菌液中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg/L;经GUS染色检测和PCR分析表明,GUS基因已初步整合进南林95杨基因组中。     

抗生素对高粱离体培养反应的影响

探讨了 5种抗生素对高粱离体培养反应的影响。在 3种抑菌抗生素中 ,羧苄青霉素和头孢霉素的抑菌效果较好。头孢霉素对高梁外植体离体培养的毒性比羧苄青霉素大 ,羧苄青霉素对愈伤组织的生长起促进作用 ,且只在高浓度才对分化有抑制作用。在农杆菌介导高梁遗传转化时 ,选用 2 5 0～ 5 0 0mg L的羧苄青霉素来抑菌是合适的。高梁不同基因型和外植体对潮霉素和卡那霉素的反应表现不同 ,但对潮霉素的反应比卡那霉素敏感。在筛选转化体时 ,以潮霉素较好 ,使用浓度对茎尖和幼胚以 2 5～ 5 0mg L为宜 ,对愈伤组织则以 5 0～ 75mg L为宜。     

根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究

以山定子叶片作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过比较在卡那霉素筛选培养基上的抗性芽百分率,研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、共培养时间、预培养时间、侵染时间对转化的影响。结果表明:预培养不利于山定子转化;菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸对转化无明显影响;侵染10min,共培养3d抗性芽百分率最高;转化后叶片再生培养基的最佳激素配比为NAA1.0mg/L+BA2mg/L+TDZ4mg/L。抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到山定子基因组中。     

农杆菌介导棉花遗传转化的影响因素

分析了农杆菌介导的棉花遗传转化的影响因素:棉花基因型是影响体细胞胚胎发生的关键因素;培养1周且分化不成熟的棉花下胚轴是诱导胚胎发生的首选外植体;高比值的KT/2,4-D可有效诱导胚性愈伤组织的产生,低比值则可以促进体细胞胚胎发生;葡萄糖比麦芽糖更适合诱导产生愈伤组织。在转化过程中,胚性愈伤是农杆菌侵染较合适的原始转化材料;菌液的培养温度、浓度、侵染时间及乙酰丁香酮(AS)浓度都会影响组织的转化效率;合适的抗生素浓度也是抗性愈伤筛选的必要保证。     

阔叶猕猴桃抗生素敏感性及遗传转化的研究

以阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia)叶片为外植体,研究了各种抗生素对形态分化和器官形成的影响,并以叶盘为受体,通过根癌农杆菌介导法获得了抗性愈伤组织和抗性芽,组织化学染色表明gus基因已在植物组织中表达。研究结果表明,对不定芽分化来说,头孢霉素(Cef)效果明显好于羧苄青霉素(Carb)。Cef浓度为300mg.L-1时效果最好,再生频率达100%,平均再生芽数达最大为9.76个芽/外植体。生根过程中高浓度的Cef(≥200mg.L-1)明显抑制生根,而Carb对生根没有显著影响。在卡那霉素(Kan)和Carb组合处理中,Carb对生根没有显著影响,但Kan明显抑制生根。随着Kan浓度的升高,生根率和平均根数迅速减少,当浓度升高到50mg.L-1时,生根完全被抑制。因此,农杆菌介导的阔叶猕猴桃遗传转化中愈伤组织和不定芽诱导过程宜选用300mg.L-1Cef来抑制农杆菌生长,Kan筛选的临界浓度为20mg.L-1。在抗性芽生根过程中Kan浓度应该控制在50mg.L-1以内,并改用Carb作为杀菌剂,生根效果会更好。该研究确定了农杆菌介导的阔叶猕猴桃叶片遗传转化中使用抗生素的种类和用量,为通过基因工程对阔叶猕猴桃进行遗传改良奠定了基础。     

抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长与分化的影响

研究了两种常用抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长和分化的影响 ,结果表明 ,头孢霉素明显抑制愈伤组织生长 ,而浓度低于 5 0 0mg L的羧苄青霉素能促进愈伤组织生长 ;两种抗生素对愈伤组织分化均有抑制作用 ,但羧苄青霉素的抑制作用要比头孢霉素小。因此 ,在农杆菌介导高羊茅遗传转化中 ,抑菌剂以选用羧苄青霉素较为合适。     

根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究

利用带有内含子gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导"鬼露甘"草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg/L,可明显抑制非转化组织的生长;300mg/L的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600nm值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。     

农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立

为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。     

根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化

报道了根癌农杆菌（Agrobacterium tumifaciens）介导的蓝猪耳（Torenia foumieri）遗传转化的方法。筛选蓝猪耳转化芽的最适卡那霉素（Kan）浓度为400mg／L；以稀释10倍的菌液浸染叶盘10～20min，固体共培养基（含20μmol／L乙酰丁香酮）上23℃共培养7～8d可获得转化芽诱导率27．2％；16h光照，8h黑暗是较理想的共培养光周期；茎段作为外植体，其转化芽诱导率要高于叶盘的转化芽诱导率，而且其转化芽比叶盘的转化芽健壮；1／2MS＋100mg／L Kan＋0．5mg／L IAA是比较理想的生根培养基。实验结果表明，根癌农杆菌介导的蓝猪耳转化获得了抗性再生植株，转化率为24．1％。     

根癌农杆菌介导苜蓿遗传转化体系的建立

以建立的苜蓿高频再生体系为基础，利用GUS染色组织分析法，研究了影响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens Conn)LBA4404菌株介导的苜蓿（Medicago sativa L)遗传转化的若干因素，建立了苜蓿快速有效的遗传转化体系，获得了转BADH基因植株。苜蓿的不同基因型、附加乙酰丁香酮的浓度、预培养与否、菌液浓度、共培养时间和卡那霉素浓度等对转化频率都有一定影响。最高转化频率可达43.3％，抗性植株经PCR和PCR-Southern blot检测表明，目的基因已整合进苜蓿基因组中。     

根癌农杆菌介导的马铃薯转化系统的优化

以马铃薯品种PB 04的叶片和茎段为外植体,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。分别比较不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对马铃薯遗传转化效率的影响,以及选择压浓度和加入时间对抗性愈伤出芽的影响,结果表明:(1)在玉米素(ZT)2 m g/L,萘乙酸(NAA)0.01 m g/L条件下能有效地提高马铃薯愈伤组织分化率;(2)外植体经过2 d的预培养,在OD600=0.8的农杆菌菌液中侵染10 m in后,抗性愈伤诱导率最高。(3)头孢霉素(C ef)比羧苄青霉素(C ar)更适合用于马铃薯外植体的遗传转化。(4)农杆菌侵染后恢复培养5~7 d再加入卡那霉素(Km)50 m g/L能有效地提高外植体的转化率。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和抗黄萎病转基因植株的获得

为了优化根癌农杆菌介导的棉花下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿抗菌肽基因（alflafa antifungul peptide gene, alfAFP）为目标,利用GUS报告基因和潮霉素抗性基因的检测方法,分析和探讨了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响。优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404当OD600值为0.5-0.7的菌液浸染5-7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10-15分钟,在含200µmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h可更有效地提高转化率。经上述条件处理的下胚轴在含50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤。愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和southern-PCR分析,发现其中12株含有外源抗病基因alfAFP,可作为棉花抗病育种的种质。     

农杆菌介导陆地棉棕彩选1号茎尖遗传转化

为建立高效的棕色棉茎尖遗传转化体系,以陆地棉棕彩选1号为材料,采用农杆菌介导茎尖的遗传转化方法,以培养7 d的棕彩选1号幼苗茎尖为受体,设计正交试验对共培养时间、共培养温度、菌液OD600、侵染时间等条件进行优化;此外,还研究了受体茎尖的大小及真空渗透等因素对转化效率的影响,初步建立了棕色棉茎尖农杆菌介导的遗传转化技术体系。结果表明,带有0.5 cm下胚轴的茎尖适合转化,适宜的农杆菌介导遗传转化条件为农杆菌菌液浓度OD600=1.0,侵染时间20 min,共培养时间3 d,共培养温度24℃。此外,真空渗透处理有助于抗性苗的发生。再生植株经在含100 mg·L~(-1)卡那霉素的培养基上筛选,获得102株抗性植株,再进行PCR鉴定和Southern杂交检测,共获得24株转基因植株,转化率为0.4%,且为单拷贝基因插入。本试验建立的优化条件为棕色棉的遗传转化奠定了理论基础。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.     

狗蔷薇类原球茎遗传转化体系的建立

在本实验室建立的狗蔷薇（Rosacanina）类原球茎（PLB）再生途径基础上,以类原球茎为转化受体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens,GV3101菌株）介导法,通过评价类原球茎GUS基因瞬时表达率,采用正交试验设计优化狗蔷薇遗传转化条件,建立遗传转化体系。最佳转化条件为：用OD600值为0．6的农杆菌菌液侵染狗蔷薇类原球茎30min,然后在含有100μmol／L乙酰丁香酮的MS培养基上共培养2d,利用此优化的转化系统,经组织化学染色及PCR检测获得了转GUS基因阳性植株。