基于cpDNA条形码鉴定铁皮石斛种质资源

为选择适合鉴定铁皮石斛的条形码,以5份铁皮石斛种质资源和1份串珠石斛(外类群)为试验材料,采用cpDNA条形码技术进行分子鉴定。结果表明,5个条形码序列(matK、rbcL、trnH-psbA、petApsbJ和rpl32-trnL)种间遗传距离均远高于种内遗传距离,符合作为条形码的基本要求,其中petA-psbJ变异位点最多(8.03%),说明其进化速率亦最快,petA-psbJ可作为石斛属候选条形码之一;单个条形码鉴定率均较低(60%),核心条形码matK+rbcL鉴定率亦较低(68.75%),而在核心条形码基础上结合其它序列(≥3)却可以显著提高鉴定率(≥81.25%),matK+rbcL+petA-psbJ鉴定率达到100%,可作为铁皮石斛分子鉴定的最适条形码组合。综上,利用cpDNA条形码技术,可将不同种质资源的铁皮石斛区分开,基本上可将不同采集地的铁皮石斛聚类;同时,建议matK+rbcL+petA-psbJ作为铁皮石斛种质资源鉴定的DNA条形码。本研究结果为铁皮石斛种质资源的快速鉴定提供了一定的参考。     

铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发

为了开发铁皮石斛EST-SSR分子标记,利用SSRIT软件对铁皮石斛近缘物种-金钗石斛的15 383条EST序列进行SSR位点查找,利用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价,之后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳对所筛选的引物进行有效性检测。结果表明,SSRIT软件共查找到370条SSR位点序列,共有379个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为2.46%。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占41.42%、26.91%和27.44%,其中二核苷酸重复中AG/CT(20.84%)和GA/TC(18.73%)最丰富;三核苷酸重复中TCT/AGA(4.22%)和GA/TC(3.96%)最丰富;而六核苷酸重复基元较多。EST-SSR平均长度为24 bp,平均每8.5条EST序列包含1个SSR位点。设计的106对EST-SSR引物中有50对能扩增出理想的PCR产物,引物有效扩增率为47.17%,其中有43对能够扩增出多态性条带,占可扩增引物的86%。本研究开发的43对引物为铁皮石斛遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建和功能基因研究等提供了重要的参考价值。     

铁皮石斛液体振荡培养的形态学观察

铁皮石斛作为传统的中药材一直被广泛应用。由于铁皮石斛的种子直接萌发非常困难,无菌播种就成为铁皮石斛种苗繁育的主要方法,但不能完全保持母本优良特性。本研究以铁皮石斛茎段无菌腋芽诱导出的类原球茎体（PLBs）为外植体,建立了其液体快速培养技术体系。该体系利用MS＋BA 2 mg/L＋NAA0.1 mg/L培养基,液体振荡培养初期,增殖量为10%-15%（鲜重比）,2个月后增殖量为30%-50%。PLBs最初乳白色,后转变为半透明浅绿色,多数成团,少量为单个;3-4个月,部分PLBs顶部变尖,开始萌发。转接到MS＋BA 0.2 mg/L＋NAA 0.05 mg/L固体培养基上PLBs转为不透明的绿色,并萌发出芽,再转接到MS＋NAA 0.1 mg/L＋香蕉100 g/L固体培养基上壮苗生根,形成健壮的完整植株。该结果可为多种兰花种苗的快速繁育提供直观的参考。     

铁皮石斛叶色突变体初步研究

为了探究铁皮石斛叶色突变机理,以铁皮石斛叶色突变体(doyo1)和正常植株(TP35)为试验材料,对其表型、叶绿素含量进行测定,并进行无参转录组测序分析。结果表明,doyo1与TP35相比,株高、茎粗均较低,生长速度较慢;叶绿素含量下降,仅为TP35的15%左右,叶绿素a/b比值(Chl a/b)显著升高。利用转录组测序技术分别从doyo1和TP35叶片中获得4.58Gb和4.90Gb有效数据(clean data),de novo组装后得到60 363条通用基因(Unigenes),其中长度大于1kb的有12 390条,N50为1 295bp。对Unigenes进行表达分析,共获得1 560条差异表达基因(DEGs)。对得到的DEGs进行生物学功能注释,获得总注释信息为1 325条。通过对注释信息进行GO和KEGG富集分析,结合定量PCR验证,结果表明,铁皮石斛叶色突变体形成的原因可能是do GLK1低水平表达和do Ftsz不表达导致叶绿体合成和分裂受阻,叶片细胞内叶绿体数量大大降低,进而叶绿素(Chl)和类胡萝卜素(Car)含量整体下降。本试验结果为研究铁皮石斛叶色突变体形成的机理提供了依据,同时,为观叶型铁皮石斛定向育种提供了参考。     

铁皮石斛引种前后主要生物活性成分对比分析

为解决我国北方地区铁皮石斛资源匮乏问题,本试验以引种入北京的铁皮石斛与安徽同一品种的铁皮石斛为材料,测定其一年水分和主要生物活性成分(多糖、生物碱、总酚、黄酮)含量的变化。结果显示,北京地区铁皮石斛多糖、生物碱、总酚、黄酮在一年中峰值出现时间分别是8、5、10和2月份,峰值含量分别为491.75、0.28、22.45和29.13 mg·g^-1;安徽地区上述活性成分峰值出现时间分别是9、4、8和1月份,峰值含量分别为509.20、0.28、26.61和28.91 mg·g^-1。引种后,北京地区铁皮石斛主要活性成分基本得到保留,表明北方地区引种铁皮石斛具有可行性;若以多糖含量为确定采摘时间的主要依据,建议北京地区铁皮石斛的最佳采摘时间为每年8月份,安徽地区铁皮石斛最佳采摘时间为每年9月份。本研究结果为北方地区铁皮石斛的引种与采收提供了数据支持,对铁皮石斛种植规模扩大有重要参考价值。     

不同林分附生栽培铁皮石斛试验初报

在安溪县桃舟乡郭村林果场内选取不同活立木,附生栽植铁皮石斛,观察并记录其成活率和生长状况.结果表明:不同附生树种对铁皮石斛生长影响存在极显著差异,枫香作为附主栽培树种其成活率最高,达91.1％;活立木附生栽培树种选择常绿落叶乔木为佳,不宜选择针叶树种.通过试验,提出林下经济发展新途径,对振兴乡村经济具有重要意义.     

铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对铁皮石斛的SCoT-PCR反应中5个因素(DNA 模板、Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物)进行优化试验。建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的SCoT-PCR的最佳反应体:20μl PCR反应体系中含有1×Buffer、30ng DNA 模板、2.5mmol·L-1Mg2+、0.15mmol·L-1 dNTPs、1.5U Taq DNA聚合酶和0.4μmol·L-1引物。对铁皮石斛的SCoT-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现本试验引物S6的退火温度为54.5℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的SCoT-PCR反应体系在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性。该优化的SCoT-PCR反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。     

浙江乐清铁皮石斛rDNA ITS序列的克隆及序列比对

为判断浙江乐清铁皮石斛（Zhejiang Dendrobium officinale）与石斛属（Dendrobium）其它物种的亲缘关系,本文提取了该石斛鲜样的DNA,利用真核生物ITS序列通用引物ITS4/ITS5进行了扩增,并将扩增产物连接转化至大肠杆菌,在对阳性克隆测序。将得到的序列与GenBank上我国石斛属12个组中34个种的rDNAITS进行了比对,并在此基础上构建了系统发育树。序列比对结果表明浙江乐清铁皮石斛的rDNAITS与黄石斛（D.tosaense）一致,其次与铁皮石斛（D.officinale）最相近,序列相似性99%。系统发育树也表明浙江乐清铁皮石斛的rDNAITS序列与黄石斛（D.tosaense）的相似程度高于其与铁皮石斛（D.officinale）的相似程度。本研究将为利用ITS序列鉴别石斛物种种属关系提供参考。     

DNA条形码与实时荧光定量PCR技术在铁皮石斛鉴定中的应用

为建立铁皮石斛准确、高效的鉴定体系,本研究以101份石斛属和蝴蝶兰属植物样品为试验材料,通过对比ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因在石斛属植物中的鉴定能力,筛选出ITS作为本研究最理想的DNA条形码。以ITS序列作为靶基因,设计铁皮石斛特异引物和特异探针,以及石斛属通用引物和探针,利用实时荧光定量PCR(TaqMan)技术,建立铁皮石斛多重实时荧光PCR检测新体系,通过特异性、灵敏度和实际样本验证,发现参试样品中的25份铁皮石斛均可被有效鉴定,与其他鉴定方法相比,该方法具有特异性强、灵敏度高(高出普通PCR 100倍)、重复性好且高效经济的优势。本研究结果对铁皮石斛的资源保护与利用起到了积极作用。     

不同预处理对铁皮石斛热风干燥特性及品质的影响

为了优化铁皮石斛干燥工艺,降低其品质劣变风险,对热风干燥前的铁皮石斛鲜条进行直接剪切、烫漂和冻融预处理。研究不同预处理条件的铁皮石斛干燥特性和品质变化;利用低场核磁共振技术分析预处理对铁皮石斛干燥过程中水分迁移的影响。结果表明,预处理是影响铁皮石斛热风干燥过程的重要因素。与直接剪切相比,烫漂和冻融预处理提高了水分有效扩散系数,缩短了干燥时间,降低了能耗,尤以冻融预处理最为显著,干燥时间缩短了44.4%,能耗降低了42.76%（P<0.05）。微观结构观察表明,烫漂和冻融预处理使铁皮石斛组织间隙变大,细胞壁受到破坏,减弱了铁皮石斛组织对水分的束缚并增强了水分流动性,引起水分的重新分布,有利于水分迁移。低场核磁共振技术分析显示,干燥过程中去除的主要是自由水,烫漂和冻融预处理均降低了自由水的脱除时间,冻融预处理去除自由水的时间最少,为120 min。与直接剪切相比,冻融预处理提高了铁皮石斛干品中多糖和多酚的含量,分别提高了10.66%和12.32%,而烫漂预处理降低了铁皮石斛多糖和多酚的含量,分别降低了11.73%和14.73%,3种预处理铁皮石斛生物碱含量差异不显著（P>0.05）。总之,冻融预处理方法可以降低铁皮石斛干燥品质劣变风险,研究结果为石斛加工规范化生产提供参考。     

施氮对铁皮石斛氮磷及非结构性碳水化合物含量的影响

为了深入认识铁皮石斛对氮施加的适应及反馈能力,本试验采用不同质量百分比浓度的尿素[0(CK)、0.2%、0.6%、1.0%和1.5%]处理红杆铁皮石斛二年生幼苗,并于处理后的第5、第15、第30天进行取样,测定茎中氮、磷、多糖和淀粉含量,研究铁皮石斛在氮添加下茎中总氮、总磷及其化学计量比,以及茎中非结构碳水化合物含量的变化。结果表明,氮处理不同程度地改变了铁皮石斛茎中总氮、总磷含量。当尿素浓度为0～0.6%时,处理30 d后的茎中总氮浓度明显下降,随着尿素浓度升高,茎中总氮浓度显著升高。茎中总磷的变化范围相对较小,处理30 d后,施加低浓度的尿素(0.2%～0.6%)更有利于促进磷的吸收和积累,当尿素浓度为0.6%时,N∶P比值降至最低,为3.17。尿素浓度为0.2%时,叶绿素含量达到最高。0.2%浓度尿素处理下的铁皮石斛多糖含量最高,随着氮肥浓度的增加,可溶性多糖含量呈下降趋势。0.2%～0.6%浓度尿素处理有利于茎中淀粉的积累,同时,非结构性碳水化合物含量保持较高水平。铁皮石斛中N∶P比值的变化主要由总N含量变化决定,总N含量、叶绿素含量及N∶P比值会影响可溶性多糖、淀粉和非结构性...     

观赏植物生物技术研究进展(英文)

观赏园艺产业的发展,需要观赏植物品种的不断创新,包括品质的提高和种类的多样化。而品种的创新一方面依赖对植物生长发育过程的理解,另一方面需要新的生物技术的创新与应用。伴随着生命科学的快速发展,新的生物技术也不断涌现,为观赏植物新品种的培育提供了新的方法与手段。本文从细胞工程,分子标记及基因工程三方面,论述了现代生物技术在观赏植物中的应用。其中重点介绍了基因工程在观赏植物性状改良方面的应用,包括形态改良,生物及非生物胁迫抗性的提高,以及采后寿命的延长。最后,对一些可能应用于观赏植物并促进其发展的生物技术进行了展望。     

铁皮石斛PRC2复合体成员的鉴定及对胁迫响应的表达分析

为了探讨PRC2复合体在铁皮石斛生长发育和胁迫响应中的功能,通过生物信息学方法筛选了铁皮石斛PRC2核心成员DcCLF、DcSWN、DcEMF2、DcFIE和DcMSI1,借助酵母双杂交技术分析了它们之间的互作关系,利用半定量PCR分析了PRC2核心成员的组织表达谱,通过荧光定量PCR检测了它们对非生物胁迫(低温、高温、脱水)和病害胁迫(齐整小核菌、灰葡萄孢霉菌)的响应情况。结果表明,铁皮石斛PRC2复合体包含5个成员:E(z)同源基因DcCLF和DcSWN、Su(z)12基因DcEMF2、ESC基因DcFIE、p55基因DcMSI1,且这5个成员间的互作关系基本符合模式植物的互作模式,也存在物种特异性,表明PRC2复合体在进化中既有保守性也有特殊性。PRC2核心成员在铁皮石斛根、茎、叶、花蕾、成花中均有表达,但不同基因的表达存在组织差异性。同时,PRC2成员响应不同的环境和病害胁迫:DcCLF受低温、高温和脱水等各种环境胁迫的显著诱导;DcMSI1和DcEMF2在齐整小核菌侵染下表达明显上调,而DcSWN在灰葡萄孢霉菌侵染下受诱导程度最大。铁皮石斛PRC2复合体在生长发育和胁迫应答中...     

秋水仙素诱导石斛多倍体的初步研究

本实验以秋水仙素为诱导剂,对石斛杂交种Dendrobium utopia ‘Messenger’×Den. whiterabbit ‘Sakurahime’的二倍体试管苗进行了多倍体诱导、细胞学观察及染色体鉴定等研究。结果表明,当秋水仙素浓度为0.4 ~0.6mg/L时石斛的诱导率较高,最高时可达62.2%。变异植株的叶片变短变厚,假鳞茎明显增粗。在显微镜下观察到变异株的气孔长度和宽度约增加21.44%和28.30%,保卫细胞的长度和宽度约增加30.88%和24.98%。     

霍山石斛快繁技术筛选研究

采用L9（3^4）正交试验设计，对霍山石斛腋茅的增殖培养基进行筛选，研究结果表明，最佳增殖培养基为MS添加6-BA 2～5mg／L、NAA0．5～1．5mg／L、SU 20～30g、CH 0～0．5g／L，且随着增殖继代次数的增加，增殖倍数有加大的趋势。     

海藻肥对低温胁迫下铁皮石斛抗氧化能力及相关基因表达的影响

以铁皮石斛'晶品一号'幼苗为试材,分别于叶面喷施不同稀释倍数(500、1000、1500倍)的海藻肥,研究其对4℃低温胁迫下铁皮石斛抗氧化生理特性及相关基因表达的影响.结果 表明:1000倍稀释浓度的海藻肥有效缓解了低温胁迫下铁皮石斛叶片失活、叶绿素降解和丙二醛(MDA)积累;促进了脯氨酸(Pro)含量的增加,以及抗氧...     

秋石斛侧芽外植体消毒方法的研究

以秋石斛栽培品种‘088’新生侧芽为外植体,研究了2%次氯酸钠（2%NaClO）和0.1%升汞（0.1%HgCl2）单独消毒和组合消毒对秋石斛侧芽茎尖、中部茎段和基部茎段的消毒效果,探索适合秋石斛侧芽消毒的有效方法。实验结果表明：（1）0.1%HgCl2对秋石斛侧芽消毒污染率低、存活率高,效果比2%NaClO好,2%NaClO＋0.1%HgCl2组合消毒效果优于单独使用一种消毒剂消毒;（2）秋石斛侧芽茎尖、中部茎段和基部茎段的最佳消毒方式分别为：2%NaClO浸泡10min＋0.1%HgCl2浸泡6min、2%NaClO浸泡10min＋0.1%HgCl2浸泡8min和2%NaClO浸泡10min＋0.1%HgCl2浸泡10min。     

137Csγ射线辐照对铁皮石斛种胚原球茎的诱变研究

研究了不同剂量的137Csγ射线辐照对铁皮石斛种胚原球茎生长和分化效应的影响。结果表明：辐照处理对种胚原球茎的生长和分化有抑制作用,尤其是对根的抑制更为明显;由于种胚原球茎的完整性好,耐受性强,其辐照半致死剂量(LD₅₀)为67.23Gy;流式细胞分析表明,大多数外部形态发生改变的植株其细胞内DNA的倍性发生了改变,出现相当多的非整倍体;此外,辐照产生的变异苗出现茎分叉、叶片缺绿或白绿相间等现象,可能是由于某些基因的表达与关闭引起的。     

铁皮石斛栽培基质的研究进展

栽培基质是铁皮石斛栽培成功和优质高产的关键因素,通过对国内现有文献的调查研究,从铁皮石斛栽培基质需满足的条件以及铁皮石斛栽培基质的来源、种类、研究现状四方面进行阐述,总结了铁皮石斛栽培基质的研究进展,以期为铁皮石斛栽培基质的深入研究提供参考。