药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化

基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果标明：药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为：在20μL的反应体系中,模板DNA 60ng,Taq酶1.00U,Mg2+ 2.00mmol•L-1,dNTP 0.20mmol•L-1,引物0.40μmol•L-1。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。     

铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对铁皮石斛的SCoT-PCR反应中5个因素(DNA 模板、Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物)进行优化试验。建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的SCoT-PCR的最佳反应体:20μl PCR反应体系中含有1×Buffer、30ng DNA 模板、2.5mmol·L-1Mg2+、0.15mmol·L-1 dNTPs、1.5U Taq DNA聚合酶和0.4μmol·L-1引物。对铁皮石斛的SCoT-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现本试验引物S6的退火温度为54.5℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的SCoT-PCR反应体系在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性。该优化的SCoT-PCR反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。     

龙眼SCoT-PCR反应体系的优化

目标起始密码子多态（start condon tardeted polymorphism,SCoT）分子标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点,具有操作简单﹑成本低廉﹑多态性丰富﹑重复性好﹑引物设计简单且通用性良好等诸多优点。本实验以石硖龙眼的新鲜叶片为试材,采用单因素试验的方法分别研究模版、引物、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液（Mg2＋）及退火温度共6因素各8个水平对龙眼SCoT-PCR扩增结果的影响。结果表明：龙眼SCoT标记的20μL优化反应体系为：10×BufferⅡ（含Mg2＋）2.0μL、DNA模板30ng、引物浓度为30μmol/L、rTaqD-NA聚合酶用量为0.45U、dNTP浓度为4.0mmol/L。适宜的扩增程序为：94℃预变性4min;95℃变性50s,49.5℃退火40s,72℃复性2min,36个循环;最后72℃延伸10min。利用24个龙眼品种验证该反应体系,1.5%琼脂糖电泳检测结果显示,扩增产物在400-2200bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性,反应体系具有良好的稳定性和可重复性。     

杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化

采用正交设计的方法,对杨树ISSR-PCR反应中5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物)在4个水平上进行优化试验。建立了适合杨树的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有1×buffer,0.12mmol/L dNTP,0.4μmol/L引物,3.5 mmol/L Mg2+,1.5UTaqDNA聚合酶和40ng模板DNA。对杨树ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现引物W95142的最适退火温度为56.1℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术进行杨树种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

施硒对药用菊花主要有效成分和花中硒含量的影响

采用砂培盆栽试验探讨施Se对药用菊花花中总黄酮、绿原酸和Se含量的影响。结果表明,在施Se量不超过2.0mg/kg时能促进药菊的生长,提高药菊花中总黄酮、绿原酸的含量,药菊花、茎叶和根的干重和花中的总黄酮、绿原酸含量均随施Se量的增加而增加;其中以施Se量为2.0mg/kg处理的效果最佳,该施Se量处理药菊花干重、根干重、花中绿原酸含量与施Se量分别为0、0.25、0.5、1.0mg/kg各处理以上各相应指标的差异均达到显著水平,该施Se量处理药菊花中总黄酮含量高于其他所有5处理,并与施Se量为0mg/kg和0.25mg/kg两处理药菊花中总黄酮含量的差异达到显著水平。过量施Se(4.0mg/kg)对药菊的生长表现出一定抑制作用,其药菊各部位生物量和花中总黄酮、绿原酸含量均低于施Se量2.0mg/kg的处理。药菊花、茎叶和根中的Se含量均随施Se量的增加而增加,菊花茎叶和根中的Se含量与施Se量呈线性相关关系,而菊花花中的Se含量(y)与施Se量(x)符合一元二次回归方程:y=-0.8175x2+6.0045x+0.1363。施用适量的Se既能显著提高药菊花中总黄酮和绿原酸含量,又能大幅提高花中的Se含量,这为富Se菊花及其系列产品的研发提供了理论依据。     

氮肥用量对药用菊花生长及其药用品质的影响

本文采用盆栽试验研究了氮肥用量对药用菊花（药菊）生长及其药用品质的影响。结果表明,氮肥可促进植株生长、花芽分化和提前开花,提高菊花产量。当氮肥用量为0.5069 g/kg土时,药菊单株鲜花总产量最高,为542.01 g /株。菊花中绿原酸、总黄酮和可溶性糖的含量同氮肥用量成反比,高氮肥处理时上述成分最大下降幅度可分别达35.48%～45.26%、28.58%～35.58%和6.42%～9.51%。随着氮肥用量增加,药菊植株次生代谢关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和菊花中磷（P）、钾（K）、钙（Ca）元素含量大幅降低,而N/P、N/K和N/Ca比值和可溶性氨基酸含量升高。高氮处理因提高植株氮含量,降低PAL活性和可溶性糖含量,从而抑制植株绿原酸和黄酮等酚类物质合成而影响菊花的药用品质。试验还表明,当氮肥用量为0.4180～0.4598 g/kg土时,菊花中总黄酮和绿原酸的累积量最高。综合比较氮肥用量对菊花药材产量、外观品质、活性成分含量与累积量等因素的影响,建议菊花生育期内氮肥用量在0.30～0.40 g/kg土范围为适宜。     

正交设计优化玉米SSR—PCR反应体系的研究

为建立适宜玉米SSR—PCR的反应体系和扩增程序,利用正交设计L16（4^5）表,对反应体系的模板DNA、dNTPs、Primers、Taq DNA聚合酶的浓度进行4因素4水平优化筛选和扩增程序的优化,确立了最优反应体系和扩增程序。即在10μL体系中,模板DNA20ng,1×PCR buffer,dNTPs62．5pmol／μL,Primers0．25pmol／μL,Taq DNA polymerase0．5U。反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性45S,60℃退火45S,72℃延伸1min,32个循环;72℃延伸5min,4℃保存。使用300对SSR引物对重组近交系的两亲本扩增,筛选出条带清晰,有差异的引物94对,用于基因连锁图谱构建和QTL定位。     

利用正交设计优化黄菠萝ISSR-PCR反应系统

利用正交设计L16（45）对黄菠萝ISSR-PCR反应体系的5因素在4个水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS分析：1各因素的不同水平对PCR反应结果又显著影响,2筛选出各因素的最佳水平,建立了黄菠萝ISSR-PCR反应的最佳体系（20ul）为：Taq酶1.5U,Mg2＋2.0mmol/L,DNA40ng,dN TP0.15mmol/L,引物0.3μmol/L。     

种植密度和氮磷钾肥对药用菊花的产量及光合效率的影响

采用4因素5水平通用旋转组合设计,研究了种植密度和N、P、K肥4种栽培因子对药用亳菊的产量、单株开花数以及群体光合速率的主效应和互作效应。结果表明:N、K、P肥和种植密度对产量、净光合速率的影响均达到显著和极显著水平;N肥对单株开花数和单朵花重量达极显著正效应,K肥也有一定效应,其他因素效应微弱。影响亳菊产量的最主要因素是N肥,其次是密度。4种栽培因子对产量的影响顺序为:N密度KP;对净光合速率的影响顺序为:NK密度P。获得亳菊高产的适宜密度为:5.5～6.0万株/hm2,施肥剂量范围为:N339.5～384.7kg/hm2,P2O5161.2～195.7kg/hm2,K2O291.5～344.0kg/hm2,三者的合理配比为:N∶P2O5∶K2O=1∶0.51∶0.89。     

栝楼ISSR－PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Tat／DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系：20μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50ng,引物的浓度为0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶的用量为0．8U,dNTPs的浓度为200μmol／L。随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条。经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析。     

狗牙根SRAP-PCR反应体系的优化

本研究以狗牙根幼叶为为试材,采用单因子试验和正交设计试验2种方法,对SRAP-PCR反应体系进行优化试验,结果表明狗牙根25μLSRAP-PCR最佳反应体系为：1.5mmol/LMg2＋、0.25mmol/LdNTP、0.4μmol/L引物、1.5UTaq酶和80ng模板DNA,最佳退火温度为50.6℃。运用该体系对30份狗牙根种质进行验证,电泳结果显示扩增条带清晰、多态性高,证明该体系稳定可靠,这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对狗牙根进行分子生物学研究提供了帮助。     

杧果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化

采用正交设计方法,对影响PCR反应体系的5个因素(Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、 引物和模板DNA)进行了优化,建立了适用于杧果的SC-SSR-PCR反应体系.结果表明,总反应体系25μL中,包含模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40μmol·L-1...     

铜、锌、硒对药用菊花主要有效成分和花中硒含量的影响

采用3因子5水平3512最优回归设计的盆栽试验,研究铜、锌、硒3元素对药用菊花主要有效成分（总黄酮、绿原酸）和花中硒含量的影响。结果表明,在满足其它大、中、微量元素需求条件下,施用铜、锌、硒三种元素对菊花花中的有效成分表现出交互作用。其中,铜、硒配施表现出正效应,并达到显著水平;而铜、锌和锌、硒配施则显示负效应。高水平的铜对菊花生长和有效成分的生成产生严重抑制作用甚或毒害作用。锌是影响菊花内在品质的重要微量元素养分,对提高菊花花中的总黄酮、绿原酸含量的作用显著;缺锌条件下,菊花总黄酮和绿原酸的生成和累积受到阻碍。铜、锌、硒3元素对菊花花中有效成分的影响机理需进一步研究。菊花花中的硒含量与硒的施入数量之间存在正相关关系,而不受铜、锌元素配施量的影响。     

利用正交设计优化黄菠萝ISSR-PCR反应系统

利用正交设计L16(45)对黄菠萝ISSR-PCR反应体系的5因素在4个水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS分析:1各因素的不同水平对PCR反应结果又显著影响,2筛选出各因素的最佳水平,建立了黄菠萝ISSR-PCR反应的最佳体系(20ul)为:Taq酶1.5U,Mg2+2.0mmol/L,DNA40ng,dN TP0.15mmol/L,引物0.3μmol/L。     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16（45）正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2＋2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

雁鹅ISSR-PCR反应体系的优化*

本试验以雁鹅基因组DNA为模板,采用正交试验设计L25（55）对PCR反应中5个因素（引物、dNTPs浓度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶）在5个水平上进行优化实验,在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,快速准确地建立雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系,为进一步进行雁鹅遗传多样性的研究、遗传图谱构建和基因定位奠定技术基础。在25uL的反应体系中,确定雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系为：ISSR引物的浓度为0.20umol/L,dNTPs浓度为0.28mmol/L,模板DNA的用量为40ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为1.0U。在正交试验设计的基础上,通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,可以更加准确地确立ISSR-PCR的最佳反应体系。     

盐城药用菊花连作障碍形成原因初步研究

以连作1年、3年、7年、15年的菊花田土壤和菊花为研究对象,考察各处理组菊花产量、发病率、土壤及菊花样品中的元素含量、土壤中可培养微生物数量及酚酸类化感物质的含量,进一步探讨不同浓度对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸、香豆素等化感物质对菊花组培苗生长的影响.结果表明:随着连作年限的增加,菊花的产量逐渐降低,发病率逐渐增加,连作15年的菊花产量仅为初茬菊花产量的19.80％,种植15年菊花的发病率达到100％.土壤中硼元素含量随连作年限的增加而逐渐减少.连作15年的菊花植株中的氮、磷、钾、铁、锰、铜、锌、硼8种元素含量,与其他组相比均有较大程度的降低.随着连作年限的增加,土壤真菌化严重,细菌和放线菌数量在3年达到最大,15年显著降低.土壤中香豆酸含量随着种植年限的增加而逐渐增加,连作7年后土壤中检测出香豆素残留.低浓度对羟基苯甲酸、香草酸及香豆酸对菊花组培苗生长发育影响不大,但香豆素、混合酚酸及高浓度的香豆酸显著抑制菊花组培苗生长和根的发育.酚酸物质积累、微生物区系的改变、土壤微量元素硼的减少可能是菊花连作障碍的主要原因.     

枣SRAP-PCR体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,建立了枣SRAP分析的优化反应体系,即20µL反应体系中含有1×buffer,dNTP 200µmol/L、引物各30ng、MgCl2 2.5mmol/L、Taq酶1.0U和模板DNA 20ng。适宜的扩增条件为94℃预变性5min;94℃变性1min,33℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,53℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环;最后72 ℃延伸5min。本研究建立的枣SRAP 体系重复性好,稳定性强。     

唐古特大黄SRAP反应体系优化及引物筛选

SRAP-PCR反应体系的优化是SRAP分子标记的基础,为建立高效稳定的唐古特大黄SRAP反应体系,进一步对唐古特大黄进行遗传多样性、种质资源分析,本研究在单因素试验基础上,对唐古特大黄SRAP-PCR反应体系主要影响因素Mg~(2+)、d NTPs、引物、Taq酶进行正交试验L9(34)。结果表明,唐古特大黄最佳SRAP-PCR反应体系为:Mg~(2+)0.5 mmol·L~(-1),d NTPs 0.4 mmol·L~(-1),引物0.2μmol·L~(-1),Taq聚合酶0.06 U·μL~(-1),总体积25μL。利用最优体系进行引物筛选,从58对SRAP引物中获得了30对条带清晰、多态性好的引物对组合。SRAP-PCR优化反应体系的建立为利用SRAP技术进行唐古特大黄种质资源分析、遗传多样性研究等奠定了基础。     

枣SRAP-PCR体系的正交优化

相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是Li and Quiros（2001）发展的新型的分子标记,该标记通过独特的引物设计对ORFs进行扩增,因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。国内有关SRAP反应条件的优化研究,一般采用单因子实验的方法,难免顾此失彼,忽视其互作效应,本实验拟采用正交试验设计的方法,从Mg^2＋、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对枣SRAP反应体系进行优化,旨在建立适合于枣SRAP反应体系,为进一步研究枣种质资源提供技术资料。