生长因子对卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨生长因子（ＥＧＦ，ＰＤＧＦ）对牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响，本研究进行了两个实验。实验１：在卵母细胞体外成熟（ＩＶＭ）中，将卵母细胞平均随机的放入表皮生长因子浓度为０，２．５，２５，５０μｇ／Ｌ的成熟培养液和对照组中。实验２：在早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）过程中，将受精卵平均随机分配入５个不同培养液的处理组：（１）ＴＣＭ－１９９＋１０％阉公牛血清（ＳＳ）；（２）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ＋ＰＤＧＦ；（３）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ；（４）ＴＣＭ－１９９＋ＰＤＧＦ；（５）ＴＣＭ－１９９＋无生长因子、其中ＥＧＦ：５０μｇ／Ｌ，ＰＤＧＦ：０．１μｇ／Ｌ。２，３，４，５组有０．１％ＰＶＡ和０．３％ＢＳＡ，并与颗粒细胞单层协同培养。卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）和早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）的方法与Ｌｕ等（１９８７）报道的相同。结果表明：浓度为５０μｇ／Ｌ的处理组分裂率与对照组无差异（８９．０％，９２．４％，Ｐ＞０．０５），而浓度为０，２．５，２５μｇ／Ｌ的处理组分裂率均显著低于对照组（７８．６％，８２．３％，８４．３％，Ｐ＜０．０５），在囊胚率和第７ｄ一级胚胎率上各组均无差异。ＥＧＦ在体     

蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养的影响，通过２３３８个卵母细胞，按２×２×２设计方法进行试验，即在体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养三个阶段的培养液中，添加与不添加蛋白质物质（体外成熟与体外培养为发情母牛血清，体外受精为牛血清白蛋白）。试验结果表明，在体外成熟阶段的培养液中，有无发情牛血清对牛卵母细胞的核成熟无显著影响（有血清组为８９％，无血清组为９０％）。但在体外受精阶段，受精液中含有牛血清蛋白质处理组的卵母细胞受精后，分裂率显著地高于无血清蛋白质组（Ｐ＜０．０１，８４％ｖｓ７２％）。同样，在早期胚胎体外培养阶段，含有发情牛血清的培养液大大促进早期胚胎的发育，与无血清组比较，其差异性极显著（Ｐ＜０．０１，３５％ｖｓ２１％）。同时，含血清组的胚胎孵化率亦显著地高于无血清组（Ｐ＜０．０１，６９％ｖｓ４７％）。本研究表明，蛋白质添加剂在ＩＶＦ和ＩＶＣ阶段是必需的，而在ＩＶＭ阶段则不甚重要。     

胎牛血清对猪体外受精卵早期发育的影响

采用猪卵母细胞体外成熟、体外受精和受精卵体外培养技术，探讨了胎牛血清对猪体外受精卵早期发育的影响。结果表明：在猪体外受精卵体外培养的第1天添加胎牛血清可增强早期胚胎发育能力，随着添加时间的延迟，胎牛血清的效果逐渐下降，添加胎牛血清的时间决定了其对猪体外受精卵体外发育的影响。     

不同成熟液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期胚胎发育的影响

本研究探讨了不同成熟液[改良TCM-199液(mTCM)和改良NCSU-23液(mNCSU)]对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期胚胎发育的影响，以期提高其受精和胚胎发育潜能。试验表明：(1)猪卵母细胞的核成熟与其周围的卵丘细胞扩展没有必然的联系，卵丘细胞扩散或成放射状不宜作为猪卵母细胞核成熟的标准，只有排出第一极体才能作为猪卵母细胞核成熟的标志；(2)利用mTCM 10％猪卵泡液和mNCSU 10％猪卵泡液的猪卵母细胞体外培养核成熟效果优于mNCSU 10％胎牛血清，但这三组成熟液对猪卵母细胞的卵丘细胞扩散和体外受精后的早期胚胎发育无显著影响。     

重离子束辐照、激素FSH/LH及丙酮酸钠对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

研究不同剂量重离子束辐照、FSH与LH的配比及添加不同浓度丙酮酸钠对绵羊卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)的影响.结果显示1.0和1.5Gy辐照可以明显提高绵羊卵母细胞ⅣM;成熟液中添加10μg/ml FSH与10μg/ml LH(1:1,即Ⅱ组)时其IVM最高,显著高于Ⅰ组(1:2)、...     

卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

本试验探讨了卵母细胞周围不同类型的卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟、受精及其随后的胚胎发育的影响。卵母细胞周围一般都含有多层卵丘细胞。按卵丘细胞的层数及形态将卵母细胞大致分为５类：（１）无卵丘细胞；（２）有２～３层卵丘细胞；（３）有４～５层卵丘细胞；（４）有６层以上卵丘细胞；（５）异常者（即卵母细胞外周有较厚的透明胶状物而无正常卵丘细胞）。以上５种卵母细胞经体外成熟培养并受精后，其卵裂率（分别为：４８．８％，７０．９％，８４．４％，８２．１％，６８．２％）及囊胚发育率（分别为：０．０％，１７．８％，３３．３％，５４．６％，２５．０％）除异常者外均随着卵丘细胞层数的增加而提高（Ｐ＜０．０５）。对含有２～６层卵丘细胞的卵母细胞成熟后进行不同程度的剥离处理。然后按剥离程度分为３组：（１）全部剥离；（２）仅剩放射冠；（３）放射冠外有２～３层卵丘细胞。受精后３组间的卵裂率无显著差异（分别为：８１．７％，８５．２％，８４．４％）。而囊胚发育率（分别为：１６．８％，２３．８％，２３．４％），全部剥离组明显低于其他两组（Ｐ＜０．０５）。试验结果表明卵丘细胞对卵母细胞的体外成熟有促进作用，从而影响随后的受精及胚胎发育。     

影响绵羊体外胚胎生产的主要因素

体外胚胎生产能够扩大胚胎来源,降低胚胎生产成本,同时有利于种质资源的国际间交流和拯救濒危动物,因此受到广泛关注(桑润滋,2002)。但目前完全体外化生产胚胎还有很多尚未解决的问题,如囊胚率较低、质量差。本研究着重于系统地探讨体外受精中的一些影响因素,以期为改善绵羊体外胚胎生产技术提供有用的参考依据。     

丁内酯-I对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响

绵羊卵母细胞经丁内酯-I(BL-I)抑制培养,然后转入成熟培养液培养不同时间,进行体外受精并观察胚胎发育情况。结果：解除8h抑制再培养8h组处于MⅡ期卵母细胞比率6.38％显著低于其它组别（P<0.01）。继续培养16h、20h的卵母细胞成熟率与对照组差异不显著,培养24h组卵母细胞成熟率(70.83%)稍高于对照组(66.18％),但差异不显著(P>0.05)。培养16h、20h组囊胚率分别为2.99%、13.64％与对照组24.39%差异显著(P<0.05),培养24h组的囊胚率20.33％与对照组差异不显著(P>0.05)。结论：BL-I对绵羊卵母细胞的成熟抑制作用是可逆的,经BL-I处理后未能提高绵羊卵母细胞体外受精和胚胎的整体发育能力。     

受精液、咖啡因、精液和抗菌素对猪卵母细胞的体外受精及早期胚胎发育的影响

探讨精液的不同处理、抗菌素、受精液种类和咖啡因对体外成熟猪卵母细胞的体外受精和早期胚胎发育的影响。结果表明：(1)受精液中抗菌素添加与否对体外成熟猪卵母细胞的体外受精无显著影响，而且不添加抗菌素的受精液也无严重微生物污染；(2)用猪冷冻精液与新鲜精液进行猪卵母细胞的体外受精对早期胚胎发育无显著影响；(3)在受精液mTBM中添加5mmol／L咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的早期发育是最好的；(4)用mTBM进行猪卵母细胞体外受精的卵裂率明显高于用mBO进行体外受精的卵裂率，但其第8d囊胚率明显低千用mBO进行体外受精的，mTBM和mBO各有优势；(5)在洗精子液含有高浓度咖啡因(15mmol／L)的情况下，无咖啡因的受精液也可进行猪卵母细胞的体外受精并发育到囊胚阶段，在受精液中添加不同浓度(0～10mmol／L)的咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的卵裂率和第8d囊胚率都无显著影响，受精液中咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的第6d桑椹胚 囊胚率的影响因浓度而异．其中以添加5mmol／L为最佳，随着浓度上升效果开始下降。     

丁内酯-Ⅰ对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响

绵羊(Ovis arise)卵母细胞经丁内酯-Ⅰ(BL-Ⅰ)抑制培养,然后转入成熟培养液培养不同时间,进行体外受精并观察胚胎发育情况.结果表明,解除8 h抑制再培养8 h组处于MⅡ期卵母细胞率6.38%,显著低于其它组(P<0.01).继续培养16和20 h的卵母细胞成熟率与对照组(常规培养24 h)差异不显著,培养24 h组卵母细胞成熟率(70.83%)稍高于对照组(66.18%),但差异不显著(P>0.05).培养16和20 h组囊胚率分别为2.99%和13.64%与对照组24.39%差异显著(P<0.05),培养24 h组的囊胚率20.33%与对照组差异不显著(P>0.05).表明BL-Ⅰ对绵羊卵母细胞的体外成熟有明显抑制作用,但其抑制作用是可逆的,而经BL-Ⅰ处理后未能提高绵羊卵母细胞体外受精和胚胎的整体发育能力.     

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

本研究探讨了乙二胺四乙酸钠(EDTA-N a)对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在不添加或添加不同浓度EDTA-N a的成熟培养液中体外成熟44~48 h,挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活,然后移到不添加或添加不同浓度EDTA-N a的胚胎培养液中进行体外培养168 h。结果说明:(1)成熟液中添加适当浓度(25~100μm o l/L)EDTA-N a对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-N a浓度为100μm o l/L时,效果最佳;(2)胚胎培养液中添加适当浓度(25~100μm o l/L)EDTA-N a,对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-N a浓度为100μm o l/L时,效果最佳;(3)成熟液和胚胎培养液中同时添加100μm o l/L EDTA-N a对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用;(4)成熟液或/和胚胎培养液中添加不同浓度EDTA-N a,对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4-细胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响。     

3种玻璃化冷冻液对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后体外发育的影响

本试验主要探索了3种玻璃化冷冻液对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后体外发育的影响。水牛MⅡ期卵母细胞经3组玻璃化冷冻液（Ⅰ：20％乙二醇（EG）＋20％二甲基亚砜（DMSO）;Ⅱ：20％EG＋20％丙二醇（PROH）;Ⅲ：20％EG＋20％PROH＋10％DMSO）毒性试验后,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组体外受精的分裂率、8-细胞率和囊胚率之间差异不显著（P〉0．05）,分裂率均显著低于对照组（P〈0．05）,但Ⅱ组8-细胞以后的发育潜力跟对照组无显著差异（P〉0．05）。进一步比较了3组玻璃化冷冻液对卵母细胞的玻璃化冷冻效果。卵子解冻后进行体外受精后,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的发育潜力均显著低于对照组fP〈0．05）,各组的8一细胞率和囊胚率之间无显著差异（P〉0．05）,但Ⅱ组卵裂率明显高于Ⅰ组（24．8±4．6％VS12．7±1．5％,P〈0．05）。结果表明,3种冷冻玻璃化保护液均可用于冷冻水牛MⅡ期卵母细胞,其中Ⅱ组处理的卵母细胞体外受精效果相对较好。     

不同化学激活方法和电激活参数对猪体外成熟卵母细胞早期孤雌发育的影响

本研究探讨了不同化学激活方法和不同电激活参数对猪体外成熟卵母细胞早期孤雌发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在体外成熟培养44~48 h后,将核成熟卵母细胞分别用:(1)不同化学激活方法[①1 0%乙醇 1 0μg/mL放线菌酮;②2.5 mm o l/L氯化锶 1 0μg/mL放线菌酮;③5μm o l/L离子霉素 2.5 mm o l/L 6二-甲氨基嘌呤(6-DMAP);④200μm o l/L硫柳汞 8 mm o l/L二硫苏糖醇进行激活处理;⑤对照组——不用任何激活剂(试验1)];(2)用不同电场强度和脉冲时程进行电激活(试验2),之后放入胚胎培养液中进行体外培养7 d。研究结果显示:(1)4种不同化学激活方法处理卵子的1原核形成率、2原核形成率和原核形成率都显著比对照组的高(P<0.05),其中离子霉素 6-DMAP组的2原核形成率和总原核形成率最高,分别为(23.1±3.5)%和(65.2±3.5)%,显著比其他处理组的都高(P<0.0 5);(2)4种不同化学激活方法处理组的囊胚率都比对照组的高(P<0.0 1),其中离子霉素 6-DMAP组的卵裂率及囊胚率最高,分别为(4 6.6±1 8.5)%和(5.6±4.2)%;(3)本研究所用的4种不同化学激活方法对猪4细-胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱没有显著影响;(4)电场强度为1.7 kV/cm、脉冲时程为50和70μs时猪体外成熟卵母细胞激活效果最好,卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数分别为:(77.4±9.7)%,(12.4±3.7)%,17.6±5.9和(75.1±10.6)%,(12.3±2.6)%,19.1±8.1。以上结果说明:(1)本研究所用的4种化学激活方法均能有效激活猪体外成熟卵母细胞,其中离子霉素 6-DMAP的激活效果最理想;(2)在本实验室条件下,采用1.7 kV/cm的电场强度、50~70μs的脉冲时程均能有效的激活猪体外成熟卵母细胞;(3)本研究所用的4种不同化学激活方法对猪4细-胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱没有显著影响。     

季节对体外成熟卵母细胞的发育能力的影响

猪的卵母细胞对外界环境非常敏感,造成猪的胚胎学相关研究是家畜繁殖学研究领域中最困难的方面之一。猪卵脆弱的主要原因是其胞质中含有大量的脂肪滴,但目前其具体生物学功能还不清楚。众所周知,猪的繁殖表现和环境密切相关,例如,温度、湿度、光照等。本研究目的是描述季节的变化对体外成熟卵母细胞发育能力的影响。连续两年从当地屠宰场获取初情期前猪卵巢,抽取猪卵丘卵母细胞复合体,并在不含BSA的NCSU-23(添加10 ng/mL EGF,10 ng/mL leptin,0.57 mm o l/L cysteine,10 IU/mL PM SG和10 IU/mL hCG)中培养44 h,然后用透明质酸酶脱去卵丘。部分卵母细胞经过电击进行孤雌激活,部分卵母细胞用来进行体细胞核移植。对于猪体细胞核移植,使用长白猪胎儿成纤维细胞做为核供体,上述脱去卵丘的卵母细胞作为胞质供体。克隆胚和孤雌胚在添加4 m g/mL的BSA液滴中培养,第2天和第6天分别计算卵裂和囊胚率(D 0:融合或激活的当天)。其中每个实验至少重复3次,所有实验都经过SPSS(13.0)统计分析。比较了不同季节每对卵巢获得A级卵(外包3层以上致密的卵丘细胞并且卵胞质均匀的卵母细胞为A级卵)和B级卵(外包2~3层卵丘细胞并且胞质均匀的卵母细胞为B级卵)的数量以及卵母细胞核成熟的比例(实验1),统计分析了不同季节孤雌(实验2)和核移植(实验3)胚胎发育能力的差异。实验1中发现春季(3~5月)COC s/ovary pairs的比例最高[7.6±3.5(春)vs 6.4±3.3(夏),6.7±2.9(秋),6.7±3.4(冬),P<0.05]。然而,没有发现卵母细胞的MⅡ百分比有显著性差异[75.3%±3.3%(春),73.5%±2.3%(夏),73.0%±4.2%(秋),76.5%±6.7%(冬),P<0.05]。实验2中观察到夏季孤雌胚胎的囊胚率显著性降低[10.2%±2.7%(春)vs 27.2%±3.5%(夏),24.2%±3.2%(秋),22.3%±3.4%(冬),P<0.05]。实验3,猪体细胞克隆胚胎在春季囊胚率获得提高[12.2%±1.3%(春)vs 10.3±1.1%(秋),8.1±1.4%(冬),P<0.05]。以上结果表明,季节变化影响体外成熟卵母细胞的发育能力。     

卵泡细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究系统探讨了卵泡细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响。颗粒细胞及其单层细胞对卵母细胞成熟后的分裂率(分别为85.4%和89.4%,对照为88.5%)及囊胚发育率(分别为35.9%和41.2%,对照为37.1%)无明显影响(P>0.05),然颗粒细胞的条件液则使卵母细胞的分裂率(81.4%,对照为88.5%)明显降低(P<0.05)。加入5×10~6/mL 内膜细胞、内膜细胞的单层细胞或25%条件液到成熟培养系统中,卵母细胞的囊胚发育率均有所提高,分别为44.1%,42.6%及39.8%。进一步探讨应用内膜细胞条件液的几个问题发现:条件液在成熟液中的合适比例为50%,收集的适宜细胞培养阶段为3～4d;条件液制备前应加入10%的血清,不加促性腺激素。这些结果表明:内膜细胞可分泌一些有利于卵母细胞成熟的生长因子。这些生长因子分泌的质和量可能取决于内膜细胞的培养阶段、血清浓度及外源激素的种类。     

牛卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究系统探讨了牛卵泡液（ＢＦＦ）对牛卵母细胞体外成熟的影响。在成熟培养液中添加１０％的ＢＦＦ，明显提高牛卵母细胞体外成熟后的囊胚发育率（４５．１％比２８．２％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞体外成熟后的受精分裂率无明显影响（８７．５％比８７．５％）。然而，当ＢＦＦ在成熟培养液中的浓度提高到４０％时，卵母细胞体外成熟后的受精分裂率（６８．６％）和囊胚发育率（１６．６％）均明显下降（Ｐ＜０．０５）。来自不同大小卵泡（２～５ｍｍ，５．１～８ｍｍ和大于８ｍｍ）ＢＦＦ的卵母细胞体外成熟培养效果无明显差异，只是来自大于８ｍｍ卵泡的ＢＦＦ将卵母细胞粘在一起，明显地降低成熟培养后的可用卵母细胞数。在成熟培养液中加入激素（２．５×１０３ｉｕ／Ｌ促性腺激素（ＨＣＧ），５０ｉｕ／Ｌ促乳素，０．０５ｍｇ／Ｌ胰岛素、睾酮和雌二醇）对ＢＦＦ的卵母细胞成熟培养效果无影响。这些结果表明，在成熟培养液中添加一定浓度的ＢＦＦ可促进牛卵母细胞获得胚胎发育能力，ＢＦＦ的这一作用与其来源的卵泡大小和激素的存在与否无关。     

卵泡直径和卵丘细胞对牛卵母细胞体外受精后发育潜力的影响

本实验以屠宰场牛卵巢为材料,研究了卵泡大小和卵丘细胞对卵母细胞体外受精后发育潜力的影响,结果表明卵泡在小和卵丘细胞直接卵母受精后的发育。直径为２～８ｍｍ卵泡中的卵母细胞经体外成熟和体外受精后,卵裂率（６０．９％ＶＳ３７．０％,Ｐ〈０．０５）和受精卵的囊胚发育率（５６．０％ＶＳ３８．０％,Ｐ〈０．０５）明显高于直径小于２ｍｍ卵泡中的卵母细胞。而直径在８ｍｍ以上的卵母细胞卵裂率显著低于２～８ｍｍ卵泡、     

乙二胺四乙酸钠、能量基质、氨基酸对猪卵母细胞的体外成熟和早期孤雌发育的影响

本研究探讨了:(1)成熟培养基中葡萄糖和丙酮酸钠剂量对猪卵母细胞体外成熟极体排放率的影响;(2)培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸和亚牛磺酸的剂量对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响,同时探讨不同浓度乙二胺四乙酸钠(EDTA-N a)对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在含不同剂量葡萄糖 丙酮酸钠的成熟液中体外成熟44~48 h,计算其极体排放率(试验1),进行化学法孤雌激活后,在含不同剂量的葡萄糖 谷氨酰胺 牛磺酸 亚牛磺酸与不同浓度的EDTA-N a的培养基中体外培养,计算孤雌激活胚的第48小时卵裂率和第168小时囊胚率(试验2)。结果表明:(1)葡萄糖 丙酮酸钠在1倍剂量(浓度分别为3.05 mm o l/L和0.91 mm o l/L)时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率为(59.3±5.0)%,当其剂量加倍时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率极显著下降(P<0.01),为(51.0±4.4)%;(2)随着EDTA-N a添加浓度的增加,猪孤雌激活胚的的囊胚发育率不断上升,添加浓度达到50μm o l/L时囊胚率最高(7.2±4.1)%,超过此浓度后囊胚率开始下降,培养基中添加适当浓度(25-100μm o l/L)的EDTA-N a对猪孤雌激活胚的囊胚发育率具有有利作用(P<0.05),添加浓度达到200μm o l/L时其有利作用消失;(3)培养基中葡萄糖 氨基酸的剂量过高(葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸的浓度分别大于5.55,1.0,7.0,5.0 mm o l/L)对猪孤雌激活胚的卵裂率无显著影响(P>0.05),但对其囊胚发育率有不利作用(P<0.05)。本研究得出以下结论:(1)适当浓度(25~100μm o l/L)的EDTA-N a对猪早期胚胎体外发育具有促进作用;(2)培养基中能量基质剂量过高会抑制猪卵母细胞体外成熟;(3)培养基中能量基质 氨基酸的剂量过高会抑制猪早期胚胎的体外发育。     

玻璃化冷冻体外成熟牛卵母细胞的尝试

通过两个试验对体外培养成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻。试验１用１０％丙二醇（ＰＧ）加上不同浓度（０％～２０％）的乙二醇（ＥＧ）作为细胞内玻璃化溶液（ＶＳ１），２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为细胞外玻璃化溶液（ＶＳ２）对卵母细胞进行冷冻。结果卵母细胞的体外受精分裂率（０．９％～２３．４％）均显著低于对照组（７５．０％）。在处理组中，以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ和１０％ＰＧ＋１０％ＥＧ作为ＶＳ１的效果较好，分裂率分别为２３．４％和２２．２％，均显著高于其他处理组。试验２以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ作为ＶＳ１，２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为ＶＳ２进行冷冻。解冻后在０．５ｍｏｌ／Ｌ或０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中１～２步或在含防冻剂的溶液中经２～３步稀释防冻剂。卵母细胞经体外受精后，分裂率在１８．２％～３０．６％之间。在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中一步脱防冻剂的卵母细胞经体外受精、体外培养后，２５个早期胚胎中有３个发育成囊胚，其它组均未发现囊胚。这些结果表明玻璃化过程对卵母细胞造成了损伤。引起损伤的原因可能是玻璃化溶液的化学毒性作用及脱防冻剂过程中卵母细胞受到的渗透压损伤。     

丁内酯-Ⅰ影响猪卵母细胞的体外成熟和发育能力

体外成熟的卵母细胞存在核成熟与胞质成熟不一致的情况,从而使得体外成熟的卵母细胞质量不高.本实验采用cdc2激酶抑制剂丁内酯-Ⅰ (butyrolactone Ⅰ,BL-Ⅰ)抑制猪卵母细胞核体外成熟,期望解决卵母细胞体外培养过程中细胞核与细胞质发育的不同步问题.结果表明,分别用0、10、20、40和80 μmol/LBL-Ⅰ处理猪卵母细胞44 h后,对卵母细胞成熟的抑制程度与BL-Ⅰ浓度的升高成正比.用20、40和80μmol/L处理时,处于生发泡(GV)期的卵母细胞分别为25％、47％和67％,与对照组(5％)相比差异极显著(P＜0.01);而到达MⅡ期的卵母细胞分别为38％、9％和0,与对照组(67％)相比差异极显著(P＜0.01).将20、40和80 μmol/L处理44 h后的卵母细胞,再在不含BL-Ⅰ的卵母细胞体外成熟培养液中培养44 h后,到达MⅡ期的卵母细胞为57％、41％和5％,与抑制44 h时相比均有显著差异,表明BL-Ⅰ对卵母细胞成熟的抑制作用是可逆的.20 μmol/L BL-Ⅰ抑制培养20 h再正常培养24 h(20 h++24 h-处理组)后卵母细胞的成熟率显著低于对照组(正常培养44 h)(65.6％vs 70.1％,P＜0.05).对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行孤雌激活,其卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均好于对照组,但无显著差异;对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行核移植(NT),获得重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均优于对照组,并且卵裂率有显著差异(68.9％vs 62.4％,P＜0.05).结果提示BL-Ⅰ处理对猪卵母细胞的核成熟有明显抑制作用,这种抑制作用是可逆的,对猪卵母细胞孤雌胚胎发育能力和核移植胚胎的发育能力有一定的提高.