褐色双孢蘑菇原生质体制备、再生条件的研究

为了提高褐色双孢蘑菇原生质体产量和再生率,本研究以褐色双孢蘑菇棕秀一号为材料,利用Design-Expert 8.0.6软件进行二次回归分析对褐色双孢蘑菇制备原生质体的条件进行优化。结果表明,原生质体最佳制备条件为溶壁酶1.35%、蜗牛酶7.01%、酶解温度30.4℃、褐色双孢蘑菇菌丝体菌龄8.36 d、酶解时间3.00 h,在此条件下原生质体产量高达4.39×10~7个·mL^-1;当溶壁酶含量为1.32%、蜗牛酶含量为6.96%、褐色双孢蘑菇菌丝体菌龄9.00 d、酶解时间2.97 h、酶解温度31.0℃时,原生质体的再生率最高(15.1%)。利用紫外诱变和化学诱变技术对褐色双孢蘑菇原生质体进行生长特性诱变,筛选获得了18株生长速率提高的突变菌株。本研究为褐色双孢蘑菇在遗传转化、基因组重排、基因编辑技术等后续分子遗传学研究提供了理论基础。     

紫花苜蓿与百脉根原生质体培养及不对称体细胞杂交

本研究拟通过原生体培养和不对称细胞杂交实现白脉根与苜蓿种间基因重组,为改良苜蓿饲用品质提供新的技术手段,用酶解法分离清水紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.‘Qingshui’)及里奥百脉根(Lotus corniculatus L.cv.‘Leon’)愈伤组织来源的原生质体,研究了酶解时间、酶液组合、甘露醇浓度、预处理条件、继代时间及培养方法等对原生质体分离和培养效果的影响。采用改良的PEG-高Ca2+-高p H法进行了不对称体细胞杂交,通过荧光染色鉴别异核体并测定融合率。结果表明,采用继代培养第8~12天的苜蓿和百脉根愈伤组织,0.55 mol·L-1CPW溶液中预处理1h或预暗培养24 h,甘露醇浓度为0.55~0.6 mol·L-1时,清水紫花苜蓿在2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶的酶液中酶解10 h,里奥百脉根在2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶的酶液中酶解12 h,经2~3个月的固液+固体培养模式可分别获得较好的原生质体分离效果及愈伤组织再生植株。清水紫花苜蓿原生质体经3 mmol·L-1IOA处理10 min,里奥百脉根经50μg·m L-1R-6G处理10 min后融合,PEG(6000)最适浓度为35%,异源融合率为3.1%,最终获得了苜蓿与百脉根的杂种愈伤组织,为进一步培育抗臌胀病型苜蓿种质提供了新的材料。     

响应面法优化超声波辅助酶解制备花生蛋白抗菌肽

为了优化超声波辅助酶解制备花生蛋白抗菌肽工艺条件,以低温冷榨花生蛋白粉为原料,采用单因素试验和响应面Box-Benhnken试验设计方法,研究酶解得到的抗菌肽复合物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率和对大肠埃希氏菌抑菌圈大小。结果表明,超声波辅助酶解制备花生蛋白抗菌肽复合物的最优工艺参数为底物浓度10%、初始pH值8.0、加酶量2.4 A·100 m L-1、超声波功率210 W、超声波频率45 k Hz、酶解温度47℃、酶解时间44 min;在此最佳工艺条件下,抗菌肽复合物对DPPH自由基清除率及大肠埃希氏菌的抑菌圈直径模型预测值分别为39.82%和1.77 cm,验证试验的DPPH自由基清除率(46.41%±2.10%)远大于模型预测值(39.82%),抑菌圈直径(1.70±0.04cm)与模型预测值(1.77 cm)相差不大。本研究结果为花生抗菌肽的分离、纯化、生物活性、构效关系及分子改造等方面的研究提供了理论依据。     

稗内脐蠕孢菌（Drechslera monoceras）原生质体制备和再生

摘要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂、缓冲液pH值以及酶解温度和时间等因子对稗内脐蠕孢菌（Drechslera monoceras）原生质体形成的影响。将培养42 h的菌丝，以0.7 mol/L KCl作为渗透压稳定剂，在30 ℃, pH 4.4～5.8条件下，经2%溶壁酶和2%纤维素酶混合酶液酶解4 h，静止条件下原生质体最大释放量达1×106/mL,再生率为0.15%。     

酶法提取白灵菇深层发酵菌丝体多糖的研究

为提高白灵菇菌丝体多糖得率,采用二次回归正交旋转组合设计方法,对白灵菇液态深层发酵菌丝体多糖的酶法提取工艺条件中的酶用量、酶解温度、酶解时间、pH值4因子的最优化组合问题进行了研究,建立了具有良好预测性能的白灵菇菌丝体多糖提取条件模型,并利用回归模型结合Matlab软件对工艺条件的最优组合、各单因子效应以及双因素效应进行分析。结果表明,当酶用量为2.53%、酶解温度39.6℃、酶解时间3.2 h、pH值7.2时,多糖得率最高可达8.23%。     

尖顶羊肚菌高生物量高氨基酸含量突变菌株选育

对尖顶羊肚菌(Morchella conicaPers.)CGAC-9506原生质体形成、再生条件进行了研究.在此基础上,诱变羊肚菌原生质体,进行高生物量高氨基酸含量突变菌株选育.原生质体形成的合适条件为①酶解系统4%蜗牛酶,5%溶壁酶,4%纤维素酶.②缓冲系统0.6mol/LKCl的磷酸缓冲液(PH6.98).③酶解时间3.5 h.④酶解温度30℃.⑤菌龄20h.原生质体产量为2.5×104个/mg.在0.3mol/LKCl+0.3mol/L环己六醇的PSA(potato sucore agar)再生培养基上,再生率为0.56%.诱变再生株M.conica CGAC-950637生物量比出发株提高7.3%,总氨基酸比出发株提高38%.     

酶解牦牛血发酵液制备抗氧化肽工艺优化

为进一步提高牦牛血枯草芽胞杆菌发酵液多肽含量,对牦牛血发酵液进行酶解,以酶解液的·OH清除率、多肽含量为主要指标,筛选酶解发酵液的最适蛋白酶,通过单因素和响应面试验优化酶解工艺,并对比菌酶联合制备产物与发酵液体外抗氧化活性。结果表明,碱性蛋白酶酶解发酵液最佳条件为:酶解时间3 h、p H值9.5、酶解温度60℃和酶底比190 U·g-1,此条件下制备得到酶解液多肽含量为5.52mg·mL~(-1),较发酵液提高2.39倍。菌酶联合制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为6.22、4.87mg·mL~(-1),发酵法制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为8.42、11.71 mg·mL~(-1),且菌酶联合制备产物的还原力优于发酵制备产物。因此,菌酶联合制备牦牛血抗氧化肽法优于传统单一发酵法。本研究结果对提高牦牛血抗氧化肽得率,增加牦牛产品附加值具有重要的意义。     

蜜蜂球囊菌（Ascosphaerapis）原生质体制备及再生

为建立高效稳定的蜜蜂球囊菌似scosphaeraapis）遗传转化体系,构建具有不同表型特征的球囊菌转化子,本实验对影响蜜蜂球囊菌菌株原生质体制备及再生的因子进行了系统的研究,同时对蜜蜂球囊菌原生质体的释放及再生过程进行了显微观察。结果表明,采用液体培养基进行24h培养的蜜蜂球囊菌菌体,在28℃条件下,应用50mg／mL的崩溃酶,经4h酶解所制备的原生质体释放量最大,达到34．00×10^5／mL。在上述条件下,采用0．8mol／L柠檬酸与NaCl的混合液作为稳渗剂,原生质体的再生率也较高,达到53．06％。蜜蜂球囊菌以菌丝断裂方式释放原生质体,原生质体再生时表现为原生质体先是突出,其后延长,并最终发育成为正常菌丝。本实验首次优化了蜜蜂球囊菌原生质体制备实验流程及原生质体再生最佳条件,为深入研究蜜蜂球囊菌的致病机理及寻找蜜蜂球囊菌致病相关基因奠定基础。     

麦麸中低聚木糖的制备及抗氧化活性研究

以麦麸木聚糖为原料,采用酶法水解制备低聚木糖,研究其抗氧化活性。在单因素基础上,采用正交试验设计,考察酶解时间、酶解温度、pH值、加酶量对低聚木糖含量影响以及酶解的最佳工艺。通过对DPPH自由基,羟自由基和超氧阴离子自由基清除率的测定,研究了麦麸制备的低聚木糖抗氧化作用。研究表明,酶法制备麦麸低聚木糖的最佳工艺条件为:加酶量600U·g-1,pH值为6,酶解时间90min,酶解温度60℃,在最优条件下的验证试验得到低聚木糖含量为5.09mg·mL-1。对低聚木糖的抗氧化研究表明,1mg·mL-1低聚木糖对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别达到76.55%和80.30%,对超氧阴离子自由基的抑制效果较弱,最大清除率为41.12%,低聚木糖能有效清除自由基,表现出良好的体外抗氧化活性。     

高抗重金属盐的微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株GXCR的遗传转化

我们曾分离到一株高抗多种重金属盐的微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株GXCR。本研究在该菌株中建立了基于携带苯菌灵抗性基因(Benr)的质粒pCPXBN-1、聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化体系。原生质体的产量和再生的最佳条件是酶解液中的酶浓度在0.6%~0.8%(纤维素酶∶蜗牛酶=1∶1)、孢子萌发后培养24 h的菌体和0.05 mol/L二硫苏半糖醇(DTT)预处理。最佳转化组合条件为3×108原生质体/mL,50μg质粒DNA组合条件下,40%PEG4000,山梨糖醇(sorbitol)-三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)-氯化钙(CaCl2)缓冲液(STC)[1 mol/L sorbitol,50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0),50 mmol/L CaCl2],室温转化20 min。在此条件下的转化效率为0.3个转化子/μg DNA。     

食用明胶的酶解及其酶解物的甲醛捕获特性研究

以氨基含量为响应值,通过Box-Behnken中心组合试验对碱性蛋白酶酶解食用明胶的工艺条件进行优化,并进一步研究明胶酶解物的甲醛捕获特性.结果表明:(1)碱性蛋白酶酶解食用明胶的最佳工艺条件为:加酶量2667U·g-1,温度61℃,pH值8.0,时间180min,在此条件下,所得酶解液的氨基含量为0.277mol·L-1.(2)酶解物能捕获甲醛,其甲醛捕获率受酶解物浓度、反应温度、反应时间及pH值的显著影响,与酶解物浓度、反应温度和反应时间呈正相关,碱性环境有利于酶解物对甲醛的捕获.100℃反应1h,1％浓度酶解物的甲醛捕获率在pH值为7时达51.09％,pH值为9时高达82.77％.     

苹果树根际高效解钾菌的筛选及鉴定

为探明苹果树根际解钾菌的种群特征和解钾性能,从苹果树根际土壤中分离获得解钾能力较强的高效解钾菌。本研究以钾长石为唯一钾源,分离获得118株具有解钾活性的菌株,重复片段PCR基因指纹分析(Repetitive-element PCR,rep-PCR)聚为29个类群。利用火焰分光光度法测定菌株解钾能力,获得5株高效解钾菌,平均解钾活性达到41.47mg·L-1,其中K105的解钾能力最强,有效态钾增长23.09%。采用H2O2消煮后测得的K+浓度升高,有效态钾增长最高达31.22%。采用形态特征观察、生理生化特性检测和基于16S r RNA基因序列的系统发育分析对高效解钾菌株进行鉴定。结果表明:K1为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、K98、K105和K115为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、K168为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。研究结果可为开辟新型高效解钾菌,为连作土壤的改良和苹果专用微生物菌肥的开发提供依据。     

桑黄菌最适生长条件的初探

桑黄具有抗肿瘤功效,但由于难以人工栽培,目前国际市场的售价昂贵.探讨了桑黄菌菌丝人工培养的条件,可供进一步液体发酵,以提取桑黄有效成分参考.经初步实验表明pH6.1～6.8、30℃条件下桑黄菌丝体生长速度最快.适宜的培养基配方为桑树枝30g,葡萄糖30g,KH2PO4 1.0g,MgSO4 0.7g,麦皮15 g,黄豆粉10 g,琼脂20g,水1L.     

人工湿地高效好氧反硝化菌的分离鉴定及反硝化特性研究

从增氧型复合垂直流人工湿地中采集样品,利用间歇曝气法富集好氧反硝化菌,并进行分离纯化,共得到10株好氧反硝化菌。其中编号为B13的菌株在初始硝态氮含量为277.23mg·L-1、碳氮比为5的条件下,24h的硝态氮去除率达92.80%,亚硝态氮积累只有12.57mg·L-1,脱氮速率达到20.58mg·L-·1h-1。16S rDNA序列分析表明,该菌与Pseudomonas stutzeri同源性达100%。选用四因素三水平L（934）正交试验表设计实验,通过测定对硝态氮去除能力和亚硝态氮的积累量,研究碳源、碳氮比（C/N）、pH以及溶解氧含量（DO）4种不同因素对B13号菌株好氧反硝化性能的影响。结果表明,该菌株对硝态氮的去除率最大可达99.88%,几乎没有亚硝态氮积累。对硝态氮去除率影响最大的因素为碳氮比,其次为pH,溶解氧含量和碳源。对应的最优条件是碳源为葡萄糖,碳氮比为10,pH为9,溶解氧含量为1.84～3.57mg·L-1。     

草地早熟禾原生质体培养与融合

以草地早熟禾品种RugbyⅡ成熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,以酶解法分离出原生质体,进行了原生质体培养;利用PEG融合法对MidnightⅡ和Nuglade的原生质体进行了融合,获得了体细胞杂种愈伤组织。研究了不同酶液组成、酶解时间、愈伤组织继代时间和渗透压对草地早熟禾原生质体游离及生长的影响;预处理对亲本原生质体活力的影响和适宜的融合条件。结果表明:采用继代培养8～10d的胚性愈伤组织,在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,酶解14～17h可得到产量和活力较高的原生质体;原生质体在KM8P培养基中培养3d后出现第1次细胞分裂,2～3周后形成小细胞团,此时添换低渗培养基2～3次,有利于小细胞团持续分裂并形成愈伤组织;试验获得了草地早熟禾品种RugbyⅡ原生质体来源的愈伤组织;5mmol/ml碘乙酰胺处理Nuglade原生质体10min及40μg/ml罗丹明处理MidnightⅡ原生质体5min,能有效地使Nuglade和MidnightⅡ原生质体失活;两品种融合PEG(6000)适宜浓度35%,融合率为9.8%。     

珍稀食用菌绣球菌液体发酵工艺条件优化

为研究绣球菌最适的液体发酵条件,同时保证其多糖的产量,以绣球菌菌丝干重和胞外多糖(EPS)产量为评价指标,采用单因素和正交试验L9(34)优化绣球菌液体发酵工艺。结果表明,最佳液体发酵工艺条件为:碳源为葡萄糖,氮源为蛋白胨,无机盐为硫酸镁,pH值5.5,C/N=20/1,培养温度27℃,此工艺条件下菌丝干重和EPS产量最高,分别为1.5 g·L~(-1)和2.87 mg·L~(-1)。本研究结果为绣球菌后续的相关研究提供了理论依据。     

一株土生克雷伯氏杆菌(k.pneumoniae)溶磷能力的初步研究

本文采用固、液体无机磷培养基研究了一株从土壤中分离得到的土生克雷伯氏杆菌102菌株,在室内纯培养条件下的溶磷能力。平板透明圈试验结果表明:菌落与菌落+透明圈直径之比为2.4~4.0;液体纯培养条件下,在无可溶性磷存在时其溶解磷矿粉的量高达72.83mg P L-1,在含有10mg P L-1、20mg P L-1磷酸二氢钾时102菌溶解磷矿粉的量分别为61.92、66.36mg P L-1;高效液相色谱测定102菌发酵液中主要含有乙酸、乳酸等有机酸。     

某些理化因子对甘蔗幼叶原生质体酶解释离的影响

研究了稳压剂、钙盐浓度、酸碱度、温度、纤维素酶浓度、材料用量等对甘蔗梢部幼叶原生质体酶解释离的影响。结果表明,稳压剂甘露醇以0.3～0.4M 为宜;加 9mMCaCl_2对稳定原生质体有利,但高浓度 Ca~(++)明显抑制原生质体的释离;在 pH5.6和30℃中,原生质体产量最高;所用 EA3—867纤维素酶以0.5～1%为好,高于3%,产量下降,破损率剧增;在规定酶量下,材料用量不宜过多。原生质体释离的动力学测定表明,酶解始期释离较慢,此后迅速增快,近高峰时又趋缓慢;温度较高或酶浓度较高时达高峰需时较短,反之则需时较长;酶解早期释离的原生质体平均体积较小,此后平均体积渐增,达高峰后平均体积又趋下降。     

玉米秸秆腐解液对苗期根际土壤酶活性及根系活力的影响

玉米连作现象在黑龙江省农田生态系统中较为普遍,秸秆焚烧既浪费资源又污染环境,研究玉米秸秆还田后的化感效应尤显重要,但秸秆还田后的效应尚不清楚。本研究以玉米(郑单958)为受体,采用盆栽试验,分析不同腐解时间(0.25、60、120、180d)、不同腐解浓度(0、0.125、0.25、0.5 g·m L-1DW)玉米秸秆腐解液对苗期根际土壤酶活性及根系活力的影响,试图从土壤酶学和根系活力变化的角度初步阐明连作状态下秸秆还田对苗期玉米生长的影响,以期为大田生产中应用秸秆还田技术提供相关科学依据。结果表明:玉米幼苗四叶、五叶、六叶期,土壤蔗糖酶、脲酶活性均在60d腐解天数,0.5 g·m L-1DW浓度处理下达到最高。土壤酸性磷酸酶活性均在120d腐解腐解天数,0.5 g·m L-1DW处理下达到最高。土壤过氧化物酶活性在幼苗四叶、五叶期,腐解60d,0.5 g·m L-1DW浓度处理下达到最高,六叶期酶活与对照相比差异均不显著。玉米幼苗根际土壤蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶的活性随腐解液浓度的增加而增加;随着玉米秸秆腐解天数的增加,呈现先升高后降低的趋势;随叶龄增加,腐解液对根际土壤酶活性的影响逐渐减弱。玉米幼苗根系活力随着秸秆腐解液浓度的增大先升高后降低;低(0.125 g·m L-1DW)、中(0.25 g·m L-1DW)浓度下对根系活力的促进作用也随叶龄增加逐渐减弱。     

复合酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的工艺研究

为了获得具有较高活性的抗冻肽,提高水产加工副产物的综合利用率,本试验以水解度和过氧化氢酶低温保护活性为指标,优化鱿鱼皮胶原蛋白酶解工艺,并对水解产物进行分离纯化及结构鉴定。结果表明,最佳酶解条件为：当底物浓度为4%、加酶量为4 000 U·g^-1时,先由碱性蛋白酶于pH值8、50℃条件下酶解2 h;灭酶后由木瓜蛋白酶于pH值6、45℃条件下酶解3 h。在此条件下所得酶解产物分子量主要在1 000～5 000 Da之间,经G-25凝胶柱分离后得到具有较高抗冻活性的F₂组分,其主要成分的氨基酸序列可能为Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu或Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。本研究为鱿鱼皮的精深加工和新型抗冻剂的开发提供了一定的理论依据。