桃果实乙烯反应因子PpERF1全长基因的克隆及序列分析

以成熟肥城桃果实的cDNA为模板,根据EST库中的核苷酸序列,设计2条特异引物分别与B26进行PCR扩增,结果得到了该基因下游包括3′ 端非编码区的765 bp大小的cDNA片段。PpERF1基因全长为1 263 bp,包含一个708 bp大小的完整开放阅读框(ORF)。序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约58个氨基酸中,同源性可达68.4%-100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折叠结构。经同源性分析,该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%～67.5%,属于同一类ERF家族成员。     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。     

金花茶CnBCH基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

利用CODEHOP和RACE方法,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了β-胡萝卜素环羟化酶(β-carotene hydroxylase,BCH)基因的cDNA全长,命名为CnBCH。碱基序列分析结果表明,该CnBCH基因全长1 089 bp,包含58 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、105 bp的3'UTR和927 bp编码308个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质为不稳定亲水性蛋白,分子量为34.42 k D,无信号肽,含有4个跨膜结构域,一个脂肪酸羟化酶超家族(FA_hydroxylase super family)功能结构域以及BCH功能结构域(PLN02601);CnBCH二级结构以α-螺旋为主,其次为无规则卷曲,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnBCH与茄科、蔷薇科等植物BCH蛋白同源性都在70%以上,与柿树(Diospyros kaki T.)BCH同源性最高。本研究为进一步了解CnBCH基因的功能及其在金花茶花瓣类胡萝卜素合成中的作用提供了帮助。     

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为JQ609678）,将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。     

大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

为了克隆分析大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因的cDNA序列,并研究该基因的组织表达规律。采用RT-PCR和RACE法,从大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)肌肉中分离和克隆大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因。结果表明：大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因全长1710 bp,其中5 '-UTR长73 bp,3 '-UTR长509 bp,编码区长1128 bp,编码375个氨基酸。大鳞副泥鳅β-肌动蛋白与其他鱼类氨基酸的同源性大于98%,核苷酸同源性大于87%;系统进化分析表明：大鳞副泥鳅β-肌动蛋白在进化上高度保守;qRT-PCR结果表明：β-肌动蛋白基因在大鳞副泥鳅的肌肉、心、肝、脾、肠、胃、精巢和卵巢共8种组织中都有表达。研究结果不仅为利用β-肌动蛋白基因作为内参基因分析大鳞副泥鳅的基因表达研究提供了序列依据,而且可为大鳞副泥鳅的分子系统学研究提供序列参考。     

Aspergillus niger 乳糖酶基因的克隆及序列分析

利用PCR及RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)菌株DL116中克隆到了乳糖酶基因组DNA，cDNA序列(GENBANK ACCESSION No.EF103141)。序列分析表明，乳糖酶基因组DNA序列长3368bp，其中含有8个内含子，cDNA编码区长2967bp，共编码988个氨基酸，氨基酸序列中共含有12个潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行了同源性比较     

夜来香LIS基因的克隆与表达分析

为了研究夜来香生物钟和花香代谢机制,本研究以夜来香花瓣为材料,利用PCR技术,从中获得了夜来香LIS基因的全长cDNA,并命名为CnLIS。生物信息学分析结果表明:该cDNA序列全长为1 800 bp,编码560个氨基酸,其中ORF为1 683 bp,5'UTR为56 bp,3'UTR为61 bp;该序列编码的氨基酸序列与软枣猕猴桃、温州蜜柑LIS基因的同源性分别为55%、50%,属于类异戊二烯合成C1超级家族。实时荧光定量PCR分析结果表明,0~12 h CnLIS表达水平较低,16 h后表达量明显上调,20 h表达量达最大,随后表达量急剧下降,其表达量随花瓣开放与闭合呈节律性变化。推测CnLIS可能参与夜来香香气形成,调控花香形成过程,同时,该基因的表达可能受生物钟基因所调控。     

马铃薯无机焦磷酸酶基因cDNA在大肠杆菌中的表达及蛋白质特征分析

通过调节蔗糖代谢途径中的协同因子无机焦磷酸（PPi）可以调控马铃薯块茎的休眠和发芽特性。本研究将马铃薯无机焦磷酸酶（PPase）基因（Gen Bank Accession No：EF091820）与载体pET-28a融合,构建了原核表达载体pET—PPA,然后导入大肠杆菌BL21（DE3）中,经SDS-PAGE分析表明PPase基因在大肠杆菌中能够表达。用生物学软件对PPase基因及其编码的蛋白质分析表明,该PPase基因与与茄属的同源性高达89％-97％,与其他物种PPase基因的同源性在77％-80％之间;系统进化树分析表明PPase与茄科茄属和藜科甜菜属的进化类群最接近;其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点,没有跨膜区;蛋白质二级结构预测显示,有63个氨基酸可能形成α-螺旋结构,38个氨基酸可形成延长链;通过亚细胞定位可知,它主要是一种细胞质和线粒体基质蛋白。     

杨梅Cu/Zn超氧化物歧化酶基因（MrSOD1）cDNA的克隆及表达分析

以杨梅叶为材料,利用RT-PCR技术克隆Cu/Zn超氧化物歧化酶基因,并利用半定量RT-PCR方法分析该基因在不同组织中的表达。获得一个杨梅Cu/Zn SOD基因编码区全长cDNA序列,长度为461 bp,编码一个由152 个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质具有Cu/Zn SOD的特征信号序列;序列同源性分析表明,其与GenBank中注册的Cu/Zn SOD序列的同源性均在77%以上。该基因命名为MrSOD1（GenBank登录号：GQ404510）。半定量RT-PCR分析显示,MrSOD1在4种组织中表达量为：果>叶>花>枝条。本实验为进一步研究MrSOD1的时空表达特性、调控途径及杨梅抗氧化伤害的分子机理奠定基础。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础.     

太子参肌动蛋白基因PhACT2的全长cDNA克隆与生物信息学分析

根据太子参肌动蛋白基因PhACT2的已知片段设计特异引物,采用RACE技术扩增全长cDNA,并通过生物信息学软件对该基因进行结构分析。通过测序及序列拼接获得PhACT2全长cDNA序列,开放阅读框为1 134 bp,编码377个氨基酸残基,分子量为41.79 k D,理论等电点为5.30。与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列与甜菜的同源性较高为88%,氨基酸序列的同源性均在95%以上。进化分析表明,PhACT2与拟南芥At ACT7的氨基酸序列仅存在4个特异位点的氨基酸差异。实时荧光定量PCR分析结果显示,PhACT2在太子参的不同器官、组织中具有稳定的表达,可作为内参基因。PhACT2全长cDNA序列的成功克隆和生物信息学分析为其在分子生物学领域的应用奠定基础。     

绵羊显性白位点基因（KIT）cDNA的克隆与序列分析

显性白位点基因座位编码一种跨膜蛋白-----肥大细胞生长因子受体,这种受体对黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用。本研究克隆了绵羊KIT基因的部分编码序列,首次获得绵羊KIT基因的cDNA序列。并与其它动物相应区域作了同源性比较,结果表明：绵羊KIT基因exon11-19 cDNA长1003bp,编码含331个氨基酸残基的蛋白;蛋白质同源性比较显示,绵羊与牛、羊、猪、人、马等的同源性大于94%;通过对绵羊该蛋白进行结构域及结构分析,为进一步研究KIT基因与绵羊毛毛色的关系奠定了一定的理论基础。     

南方根结线虫延长因子2基因cDNA全长克隆和序列分析

以南方根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3′末端和5′末端的RACE,获得延长因子基因2 cDNA全长。此cDNA全长序列为2434 bp,包括2334 bp的完整ORF,编码一含777个氨基酸的多肽。该基因命名为Mi-eft2,其推导蛋白MI-EFT2的编码氨基酸与秀丽隐杆线虫的Ce-eft1,Ce-eft2,Ce-eft3,Ce-eft4基因的推导蛋白的同源性分别为26.7%、86.9%、13.8%和8.9%。蛋白功能分类预测MI-EFT2是一种在蛋白质延长过程中起作用的GTP水解酶,与真核生物的延长因子2功能相同。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆及表达分析

为了进一步研究橡胶生物合成的分子机制,根据巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）cDNA文库中的EST序列,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离了一个巴西橡胶树钙调蛋白基因,命名为HbCAM1。分析结果显示,该基因cDNA全长775 bp,含有完整的阅读框架,编码区为450 bp,编码149个氨基酸,5’非编码区26 bp,3’非编码区299 bp。通过序列比对以及结构预测分析,HbCAM1编码的氨基酸序列与蓖麻、毛葡萄、烟草、麻风树中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到100%、100%、99%、99%。半定量RT-PCR分析显示,HbCAM1基因可能通过对相关代谢基因表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控。     

花生Clp蛋白酶基因(AhClpP)的克隆与序列分析

Clp蛋白酶通过蛋白质水解作用来清除细胞内由逆境引起的异常和具有潜在毒性的蛋白或多肽,从而保证细胞正常的生理功能。从优质大花生鲁花14种子不同发育时期混合cDNA文库中发现一条序列,全长为1 212 bp,3′端含有polyA尾,通过blastx搜索得知其为Clp蛋白酶基因。该序列与GenBank中EZ736390.1的序列相似性达到99%。以该花生cDNA序列为模板设计引物,以花生幼嫩种子cDNA为模板克隆得到花生Clp蛋白酶基因。序列分析表明,AhClpP基因的开放阅读框长度为843 bp,编码280个氨基酸,预测其分子量为30.9 kDa,等电点为9.07,编码的蛋白包含S14-ClpP-2保守结构域,无信号肽,定位于线粒体。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对,发现与拟南芥、蓖麻的Clp蛋白酶同源性较高。花生AhClpP基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。     

播娘蒿甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和表达分析

采用RT-PCR技术克隆了播娘蒿的甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA序列(DsBADH)。DsBADHcD-NA序列全长1653bp,其中开放阅读框长1503bp,编码一个由501个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为54kD,pI为5.5。序列比对结果表明DsBADH与其它物种的BADHs无论在核酸水平还是在蛋白质水平上都表现较高的同源性,表明BADH基因家族具有较高的保守性。DsBADH基因的氨基酸序列在进化上与同属十字花科植物BADH基因距离较近。蛋白质序列存在一个编码十肽的高度保守序列,该结构在醛脱氢酶中是高度保守的,这些残基可能包含NAD 结合位点及酶催化位点,而且含有与酶功能有关的醛脱氢酶高度保守的氨基酸残基Cys,表明DsBADH可编码活性蛋白。N端存在信号肽,初步将该酶定位于叶绿体。半定量RT-PCR分析表明,DsBADH在根、茎、叶以及角果中均表达,但在角果中的表达显著高于其它组织,而且表明DsBADH受盐诱导正调节表达。