小鼠腹水IgG类单克隆抗体纯化方法的研究

分别采用辛酸硫酸铵法(CA AS)、硫酸铵沉淀法(AS)和DEAE离子交换层析法对小鼠IgG腹水进行了纯化效果的比较。结果表明:CA AS法提取IgG的纯度为67.5%,高于AS法(43.2%),低于DEAE法(100%);CA AS法提取IgG的回收率为51.2%,远高于DEAE(8.9%),略低于AS法(63.8%)。将不同纯化方法获得的IgG定容至相同浓度。ELISA试验结果表明:DEAE法的OD值明显降低,表明DEAE纯化方法降低了IgG的免疫学活性。说明CA AS法是一种操作简单、成本低、纯化效果和回收效果较佳的提取小鼠腹水IgG的首选方法。     

从培养上清中纯化IgG单抗的一种改进方法

描述了一种从杂交瘤细胞培养上清中纯化鼠单抗的方法。本法是将以前描述了的浓缩和纯化单抗三种方法的结合。首先，将杂交瘤细胞生长于一种Ｄｉａｃｕｌｔ透析系统生产含毫克量单抗的培养上清，接着用聚乙二醇６０００（ＰＥＧ６０００）沉淀纯化培养上清中的单抗，最后用饱和硫酸铵法丙次沉淀。ＰＥＧ６０００处理使上清浓缩，引起硫酸铵免疫球蛋白沉淀物中密度的改变，并导致含纯的鼠单克隆抗体的薄层的形成。本法从单抗制备中除去     

犬2型腺病毒纤突蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

犬2型腺病毒(canine adenovirus-2,CAV-2)主要引起犬科动物的传染性呼吸道疾病和消化道疾病,且其传染性极强,全球范围内感染率非常高,但现有的临床防治措施难以完全阻断病毒的传播和快速特异性治疗患病动物。为了获得可用于CAV-2基础病毒学研究和临床诊治所需的单克隆抗体,本研究将浓缩纯化的CAV-HN45株灭活后免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验和间接免疫荧光试验筛选出2株能分泌CAV FIBER蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞系：1-A12-C6、8-A12-B10,抗体亚类分别为IgG2a和IgG2b。腹水纯化后质量浓度为1 g/L抗体的间接免疫荧光效价为1-A12-C6:1∶8 192; 8-A12-B10:1∶2 048,2株单克隆抗体均不能用于免疫印记试验检测。抗体具有体外中和病毒的活性,1-A12-C6和8-A12-B10抗体的CAV中和效价分别为1∶256和1∶64。本研究单克隆抗体的成功制备为建立快速、高效的CAV-2免疫学检测技术和CAV-2的防治提供了依据。     

三种方法纯化相思子毒素单抗的比较

采用不同的方法纯化相思子毒素单抗,寻求一种效果好、操作简便的纯化方法。采用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-蛋白A亲和层析法三种方法分离纯化相思子毒素单抗,并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、BCA蛋白检测试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)对纯化产物进行相对分子质量、浓度、纯度、回收率及免疫活性的鉴定。结果表明,纯化后单抗的回收率以硫酸铵沉淀法及辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵-蛋白A亲和层析法较低;产物纯度以硫酸铵-蛋白A亲和层析法和辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵沉淀法较差;不同方法纯化后的单抗活性未见降低。     

两种方法纯化猪血清免疫球蛋白IgG的比较

为了从猪血清中纯化免疫球蛋白IgG,得到纯度更高的样品,采用饱和硫酸铵分级沉淀和Protein G柱吸附分离两种方法进行纯化,将获得的IgG经SDS-PAGE凝胶电泳纯度鉴定和HPLC浓度测定,结果表明,利用Protein G柱吸附分离纯化出的样品在纯度和浓度方面都要高于盐析法,Protein G柱吸附分离纯化IgG更适合于实验室小规模的操作,能够获得纯度高的样品。     

A型肉毒毒素Hc基因的原核表达、纯化及单抗的制备

在大肠埃希茵中高效表达的重组A型肉毒毒素保护性抗原,是以包涵体形式存在.溶解后的包涵体溶液经过处理,用镍柱亲和层析法纯化,得到纯度约为90%的融合蛋白.利用纯化的重组抗原BoNTa免疫Balb/c小鼠,获得分泌抗BoNTa特异性的3株杂交瘤细胞株2A2、4F7和2A8,其单抗鉴定均为IgG1亚型,滴度达到1:105.高纯度和活性单抗的获得为毒素检测试剂盒的研究奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合病毒结构蛋白2b研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状并导致高死亡率的传染病,近年来国内外学者对病原进行了更广泛深入的研究。2b蛋白是新发现的小结构蛋白,分子质量约10 ku,能够诱导产生中和抗体,是ORF2的优势蛋白,研究发现其是一种病毒离子通道蛋白,与病毒感染过程有关,它可以促使PRRSV粒子脱壳,释放RNA到宿主细胞内,但对病毒的装配不起作用,论文就该蛋白的结构和功能进行了综述。     

小鼠附睾分泌蛋白Fam12b的原核表达与纯化

本研究旨在克隆小鼠附睾基因fam12b,构建pET28(a)-fam12b-fam12b原核表达重组质粒,从大肠杆菌Rosetta (DE3)中获得融合蛋白.应用RT-PCR方法从小鼠附睾中扩增出fam12编码序列,串联克隆至原核表达载体pET28(a),转化大肠杆菌Rosetta (DE3)细胞,诱导表达,Ni NTA纯化融合蛋白.结果显示,获得小鼠附睾基因fam12b,纯化后的融合蛋白经过SDS-PAGE和Western印记分析鉴定,在相对分子质量31 kD处有特异的条带,并获得高纯度融合蛋白.本研究成功克隆了小鼠附睾基因fam12b,并从Rosetta (DE3)中获得高纯度融合蛋白,为进一步研究Fam12b的功能创造了条件.     

b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化方法的优化

对b型流感嗜血杆茵荚膜多糖纯化工艺中冷酚抽提次数、沉淀核酸的乙醇浓度、沉淀糖精的乙醇浓度进行研究.结果表明,最佳纯化工艺为冷酚抽提4次,300 mL/L的乙醇沉淀核酸,650m-L/L的乙醇沉淀糖.所建立的提取纯化工艺提取的荚膜多糖纯度高,各项指标能够达到WHO的规程要求.     

乳制品中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白检测方法研究进展

随着消费者对A2 β-酪蛋白的关注度提升,A2 β-酪蛋白相关产品不断更新换代。A2 β-酪蛋白常用检测方法有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、液相色谱–高分辨串联质谱法、毛细管区带电泳法、试剂盒检测法等。本文对β-酪蛋白遗传变体A1 β-酪蛋白和原始形态A2 β-酪蛋白的功能特点、检测方法、定量分析进行综述,说明检测方法的原理和试剂药品的作用机理,加强对A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白检测方法的改进与优化,为A2 β-酪蛋白应用于功能性食品、婴幼儿配方食品提供理论依据。     

PCV2b Cap蛋白重组杆状病毒的构建及鉴定

猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2b Cap蛋白,为制备PCV2b Cap蛋白亚单位疫苗打下基础。     

亲和层析和反相层析纯化O型口蹄疫病毒单抗的比较

为了获得有效纯化抗体的方法,将杂交瘤细胞株（4C3）用细胞培养液扩大培养后制备腹水,所得腹水依次用50％和45％的饱和硫酸铵沉淀后再分别用亲和层析和反相层析进一步纯化抗体,并用SDS—PAGE和间接酶联免疫吸附试验分析其纯化抗体的纯度和活性。结果表明,亲和层析获得了较高纯度的抗体,并且抗体活性没有丧失,反相层析获得的抗体有较好的活性,但抗体中还有微量的杂蛋白。因此亲和层析是单抗纯化的较好途径,所获得的高纯度单抗将为O型口蹄疫病毒的基础研究和应用研究提供良好的物质基础。     

从培养上清中纯化IgG单抗的一种改进方法

描述了一种从杂交瘤细胞培养上清中纯化鼠单抗的方法。本法是将以前描述的浓缩和纯化单抗三种方法的结合。首先,将杂交瘤细胞生长于一种Diacult透析系统生产含毫克量单抗的培养上清,接着用聚乙二醇6000(PEG6000)沉淀纯化培养上清中的单抗,最后用饱和硫酸铵法再次沉淀。PEG6000处理使上清浓缩,引起硫酸铵免疫球蛋白沉淀物中密度的改变,并导致含纯的鼠单克隆抗体的薄层的形成。本法从单抗制备物中除去了污染的牛血清免疫球蛋白及其它血清和细胞蛋白。     

两种纯化羊驼BVDV抗体血清的方法

为了纯化2种用于不同用途的羊驼牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体血清,笔者分别使用(A|")KTAavant纯化柱直接纯化和抗原偶联亲和层析纯化特异性BVDV抗体,用ELISA测定抗体效价,SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot分析抗体的特异性。结果表明,2种方法纯化的抗体特异性均较好,可根据后续具体试验选择纯化方法。     

鸭血清IgG的提纯方法比较

本文对鸭血清分别采用了硫酸钠法、辛酸-硫酸铵法、硫酸铵法进行了鸭IgG的提取。提取后的鸭IgG样品用纯度和蛋白含量两个指标来衡量。用辛酸-硫酸铵法提取的鸭IgG样品蛋白含量为9.45mg/ml,纯度能达到用于免疫标记技术的要求,而且操作简单、价格低廉,适于从大批量样品中提纯鸭IgG;用硫酸钠法提取的鸭IgG样品蛋白含量为9.14mg/ml,相对较高,但纯度较低;用硫酸铵法提取的鸭IgG样品蛋白含量、浓度都较低。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D区单抗的制备及其抗原表位的初步研究

应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E（A）,在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E（A）,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选,获得了C3、A1两株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA结果显示,其腹水效价为1∶128000和1∶256000。Western blotting结果证实,单克隆抗体C3和A1能与猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）发生特异性的反应,表明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白的保守线性表位。     

细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种早期诊断动物细粒棘球蚴病的方法,诱导表达含PET-EgAgB8/2载体的原核表达菌,以表达纯化蛋白为抗原,制备单克隆抗体,并以制备的抗体建立检测细粒棘球蚴病夹心ELISA方法。结果显示,原核表达菌在37℃诱导培养,菌体上清中大量表达,经验证为目的蛋白,用纯化蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选得到9株具有良好特异性、稳定分泌单克隆抗体的细胞株,经两两配对,选择75C86/15作为包被抗体,27E57/32为酶标二抗,当包被抗体浓度为1.42μg/mL, 4℃包被过夜、用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭、抗原作1∶100稀释、酶标二抗1∶1 000稀释、反应底物作用15 min时效果最佳,检测方法的特异性为98.8%,敏感性为95.3%。成功制备细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单克隆抗体并建立了ELISA检测方法。     

新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因的克隆与表达

以表达新疆绵羊种布鲁氏菌外膜抗原蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b,探索其作为诊断抗原和分子疫苗的可能性。采用PCR扩增技术,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组DNA中扩增出OMP2b基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PE-28a(+),构建成重组质粒,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测有无蛋白的表达。结果表明,获得长约1 083bp的PCR片段,序列分析结果与已知绵羊种OMP2b同源性达89.72%;SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量39 ku获得了新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因片段,并在大肠杆菌中实现了表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒2b基因的克隆和原核表达

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株2b基因序列,设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从PRRSV中扩增出222 bp的片段,并克隆至pMD18-T,连接到pGEX-4T-1表达载体,将阳性重组质粒pGEX-4T-2b转化到BL21(DE3),对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,所得重组蛋白的分子质量大小为35 ku,与预期结果相同,且具有良好的免疫学活性。