非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

狂犬病病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

为了建立可绝对定量狂犬病病毒(RABV)的微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本试验根据RABV基因组起始区域设计引物和探针,继而优化引物和探针浓度以及退火温度,并对建立的ddPCR方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析。结果显示：ddPCR方法的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃;ddPCR方法的标准曲线相关系数(R²)为0.999,呈现良好的线性关系;灵敏度高,最低可检测到3.37 copies/μL;特异性良好,与常见犬病原无交叉反应;重复性好,检测结果稳定。临床样品的检测结果显示,本试验建立的狂犬病病毒ddPCR方法与实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)方法的符合率为100%。结果表明,本试验建立的狂犬病病毒微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于狂犬病病毒的绝对定量检测。     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立

建立一种具有高灵敏度的检测非洲猪瘟病毒的微滴数字PCR方法,为非洲猪瘟的快速诊断和流行病学研究提供技术支持。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中提供的qPCR检测方法的基础上,建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法的最低检测限可达0.8copies/μL,敏感性高于qPCR方法,不与猪常见的6种病毒发生交叉反应,而且重复性较好。采用建立的微滴数字PCR和OIE的qPCR方法分别对78份临床病料进行非洲猪瘟病毒的检测,结果显示2种方法的符合率为100%。本研究建立的微滴数字PCR方法具有理想的敏感性和特异性,适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。     

水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用

为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×10⁷拷贝/μL～1.43×10⁰拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检...     

野生型非洲猪瘟病毒多重数字PCR方法的建立

为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为10² copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵...     

鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus, ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列，筛选了特异性探针引物组，采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化，并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较，同时对其他常见禽病病原体进行检测，以及对40份临床样品进行检测，评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示，该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍，最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测，结果均为阴性；批内和批间重复性较好，变异系数小。结果表明，所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性，可成功用于快速定量检测ChPV感染。     

猪圆环病毒1型微滴数字PCR定量检测方法的建立

以猪圆环病毒1型ORF1基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法。对ddPCR反应中的探针浓度进行了优化。结果显示:ddPCR反应中的最佳探针浓度为250nmol/L;ddPCR方法线性相关系数(R2)为0.999,呈良好的线性关系;检测限为7.8copies/20μL;变异系数为2.7%;与其他病毒无交叉反应。通过对临床样品的检测,检测结果与实时荧光PCR结果一致。结果表明:新建立的ddPCR方法敏感性高、特异性强,可用于猪圆环病毒1型的定量检测。     

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R²=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～10⁹,4.3×10³拷贝/μL～4.3×10^-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品...     

微滴式数字PCR定量检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)的方法，并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列，在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列，应用合成的引物和探针建立ddPCR检测AEV方法，并测定其特异性、灵敏性和重复性。结果显示，建立方法的最佳引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L,退火温度为58℃。特异性测试结果，本方法只检出AEV,没有检出禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽偏肺炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，且无交叉反应。灵敏性结果显示，本方法对pMD18-AEV重组质粒DNA最低检测限为5.9拷贝/μL,敏感性高。用4个连续稀释的pMD18-AEV重组质粒DNA的拷贝数的对数值与ddPCR检测的拷贝数的对数值绘制绝对定量曲线，其曲线呈良好的线性关系(R²=0.999 4),结果稳定。3次重复检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对采集的病鸡临床样品65份进行ddPCR和荧光定量PCR检测，结果...     

H7亚型禽流感病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立

本文建立了一种H7亚型禽流感病毒微滴式逆转录数字PCR方法,为H7亚型禽流感病毒核酸的定量检测和临床低浓度样品的诊断提供一种检测技术。根据H7亚型禽流感病毒的HA基因,设计了1对特异性的引物和探针,建立了H7亚型禽流感病毒的微滴式逆转录数字PCR方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价,并初步应用于临床样品的检测。结果为,该方法的最低检出限为3 copies/μL;与H1亚型、H3亚型、H6亚型禽流感病毒、新城疫病毒、鸡马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病毒和鸡传染性法氏囊病病毒无交叉反应;检测12次200倍稀释的H7N9亚型禽流感病毒(Re-2株)的核酸,变异系数为3.38%;检测了30份临床样品,结果均为阴性。结果表明,该方法的敏感性高,特异性和重复性好,适用于H7亚型禽流感病毒的临床检测和标准物质的标定。     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性高、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟的诊断以及猪瘟病毒强、弱毒株鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用做一简要综述,为我国猪瘟的综合防控提供参考。     

1种检测新城疫病毒的微滴式数字PCR方法

本研究旨在构建一种新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以NDV F基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了NDV ddPCR。对ddPCR反应引物和探针浓度、退火温度进行了优化，并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行测定。试验结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900和250 nmol·L^-1，最佳的退火温度为55℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.8 copies·μL^-1，与禽传染性支气管炎病毒等其他6种病毒无交叉反应，样本重复的变异系数为2.4%。结果提示，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对新城疫病毒感染的临床样品进行定量检测。     

A Droplet Digital PCR Method for Detection of Newcastle Disease Virus

This experiment was conducted to establish a droplet digital PCR (ddPCR) method for the detection of Newcastle disease virus (NDV). A ddPCR method was developed, which the primers and probes were designed based on the conservative regions of F gene of NDV. The concentration of primer and probe, the annealing temperature in ddPCR reaction were optimized. The sensitivity, specificity and reproducibility of ddPCR method were evaluated. In results, the optimal primer concentration and the probe concentration were 900 and 250 nmol·L^-1, the optimum annealing temperature was 55℃. The detection limit of ddPCR method was 1.8 copies·μL^-1 with a good linear response, it had no cross reaction with other six viruses (include IBV), the coefficient of variation of sample repetition was 2.4%. All the results showed that NDV ddPCR was sensitive and specific, it was suitable for quantitative detection of clinical samples infected with NDV.     

非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立

非洲猪瘟给全球养猪业造成了严重危害,需要建立更加敏感的PCR检测方法.根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的VP72基因序列,设计PCR引物,建立了 ASFV PCR检测方法.以合成的VP72基因片段为阳性对照,进行敏感性试验和特异性试验.同时与世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR引物进行对比试验.结果显示,建立的方法可用于...     

斑点免疫金渗滤法检测猪瘟抗体的研究

以猪瘟抗原包被硝酸纤维素膜，然后用胶体金标记SPA，建立检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒。通过胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)直接显色，阳性者出现红色斑点，结果易于判断。整个试验过程仅需5min，操作简单，与猪兰耳病、猪伪狂犬病、猪细小病毒、新城疫和禽流感等阳性血清不发生交叉反应。同时将该法与目前猪瘟的常规检测方法Dot—ELISA法和间接血凝试验同时对200份猪血清进行猪瘟抗体检测比较，符合率达98．4％和98．9％。说明该法微量、特异、敏感可靠，检测时间短，效果直观，非常适用于猪瘟的早期诊断和普查以及疫苗免疫效果后抗体水平的检测。     

一种用于非洲猪瘟病毒检测的PCR方法

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因设计引物,建立一种检测非洲猪瘟病毒的PCR方法。应用本研究所建立的方法与OIE参考的方法进行比较,并对参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组以及本实验室收集的野外样品进行检测。结果显示:本研究设计的引物具有良好的特异性,与猪的其他病原没有交叉反应;其敏感性与OIE参考的方法相当;所建立的PCR方法能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组,野外样品检测均为阴性。根据上述研究结果,本研究所建立的方法具有很好的应用性,能够用于非洲猪瘟疫病的诊断以及防控。     

猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用

旨在建立猪瘟病毒(CSFV)化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法.该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病...     

1种布鲁氏菌微滴式数字PCR检测方法的建立

本研究旨在构建1种布鲁氏菌(Brucella)微滴式数字PCR方法(droplet digital PCR,ddPCR).以布鲁氏菌BCSP31基因为靶基因,选取保守区域设计引物和探针,构建了布鲁氏菌微滴式数字PCR方法.然后优化了ddPCR反应中的引物、探针浓度及退火温度,并进行方法的灵敏度、特异性和重复性试验.结果...     

Establishment and Application of Real-time Quantitative PCR Assay for Detection of Classical Swine Fever Virus

A Real-time quantitative PCR assay for detection of classical swine fever virus (CSFV) was developed using the specific probe and primers designed basing on the E2 gene of CSFV. The Real-time quantitative PCR assay was established using the total RNA of CSFV as template. The specificity, sensitivity and repeatability of the assay were tested, and samples taken from clinic suspicious CSFV infected pigs had been testified by the established assay. The results indicated that the Real-time quantitative PCR assay was successfully established, and showed a good linear relationship at a template range of 10¹ to 10⁶ copies/μL with a coefficient correlation of 0.999; The specificity of the assay revealed that amplifications were showed on CSFV samples, but other pathogens had no amplifications; The sensitivity of the assay was 10 copies/μL nucleic acid and 1 TCID₅₀/mL virus; Meanwhile,19 positive samples were detected, which were consistent with results of CSFV detected by Nested RT-PCR, cloning and sequencing. The eatablished Real-time quantitative PCR assay was specific, sensitive rapid and suitable for early detection and epidemiological study of CSFV.     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10⁰~10⁶拷贝·μL^-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL^-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。