低温条件下小麦叶绿体基因启动子甲基化的变化

为建立小麦叶绿体基因启动子甲基化的检测体系,检测低温胁迫下小麦叶绿体编码基因甲基化的变化规律并分析叶绿体编码基因表达的调控模式,以低温敏感型小麦返白系及其对照矮变1号为材料,选取4个在低温条件下两个材料间表达有差异的叶绿体基因petN、trnC、petD和rrn16S,通过亚硫酸盐测序法(BSP-seq)分别测定低温处理后这些基因(TaMET1,TaDRM和TaCMT)启动子的甲基化率,并用qPCR的方法对这4个基因以及预测定位于叶绿体的三个DNA甲基转移酶基因进行表达量检测。结果显示,叶绿体基因组总的甲基化水平在低温条件下持续增加,基因间启动子甲基化水平变化并不完全一致,基因型之间也略有差异。4个基因的表达量与甲基化水平的相关性不同,petN的表达对甲基化比较敏感,低温诱导甲基化率增加,基因的表达量则下调,但其余3个基因的表达与甲基化率的变化无直接相关性。返白系中三个DNA甲基转移酶基因的表达在低温条件下都呈上调趋势,但矮变1号中的TaMET1与TaCMT基因表达下调。结果为深入研究低温下小麦叶绿体基因甲基化的变化规律及其对叶绿体基因的调控机理奠定了基础。     

水稻种子特异性谷蛋白GluB1启动子在水稻愈伤组织中驱动外源基因表达

【目的】水稻谷蛋白启动子GluB1(GluB1promoter,pGluB1)常用于外源基因在种子中特异性高效表达的研究,也是研究种子储藏蛋白基因表达调控机制的模型。前人研究表明,pGluB1只在水稻胚乳中表达,而在根、茎、叶片、叶鞘、颖壳等组织中均无表达活性。研究的目的是为了克服种子特异表达启动子筛选周期长的缺点。【方法】将由pGluB1驱动的霍乱毒素B亚单位和重组胰岛素原组成的融合基因(a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin, CTBIN)表达载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS经农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织。通过RT-PCR和蛋白质印迹杂交试验检测融合基因CTBIN在水稻愈伤组织中的转录和翻译表达。【结果】获得的7个转基因愈伤克隆中,有6个克隆的融合基因CTBIN在转录水平上表达。选取其中4个克隆进一步进行蛋白质印迹杂交试验检测证实融合基因CTBIN均在翻译水平上表达,而且从分子量大小推断融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信号肽序列(24个氨基酸残基)在所测的愈伤组织细胞中均被成功切除。【结论】水稻种子特异性启动子pGluB1在愈伤组织中具有驱动外源基因表达活性,种子蛋白体亚细胞定位信号肽序列可在愈伤组织细胞中被切除。这为在愈伤组织细胞中快速检测种子特异表达启动子活性和探索愈伤组织中蛋白质的亚细胞分拣机制奠定了基础。     

陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列分析

为了筛选棉花抗逆转基因育种的候选启动子,根据陆地棉脱水素基因GhDHN1的cDNA序列和陆地棉基因组序列,利用生物信息学分析方法,获得棉花陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列。结果表明,该启动子上多个位点含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,并含有非生物逆境胁迫响应元件、响应植物激素顺式作用元件、多种光调控相关的顺式作用元件以及胚乳表达顺式调控元件等。推测GhDHN1基因的启动子受光诱导,同时受低温和干旱胁迫等非生物逆境的诱导,参与棉花的生长发育。     

水稻穗萌抗性与OsVP1基因启动子序列及其表达水平的关系

以易穗萌的冈46B、穗萌抗性好的桂R106和深97B3个品种为材料,比较研究了穗萌抗性不同的水稻品种新鲜种子胚中OsVP1基因的表达水平及OsVP1基因的启动子序列差异。结果表明,在开花受粉后不同时间的新鲜种子胚中,桂R106和深97B中OsVP1及受其调控的下游基因OsEM的表达水平均高于冈46B;且与冈46B相比,桂R106和深97B中OsVP1基因的表达对ABA更敏感。比较3个品种的OsVP1基因启动子序列,发现易穗萌的冈46B仅有一种启动子序列,而抗穗萌的桂R106和深97B有2种类型启动子序列,其中一种与冈46B的一样,另一种与冈46B中OsVP1启动子序列相比有3处碱基差异,推断桂R106和深97B中可能存在至少2个OsVP1基因拷贝。这可能是桂R106和深97B中OsVP1基因表达水平高于冈46B,进而导致其对穗萌的抗性强于冈46B的主要原因。     

白木香查尔酮合成酶基因(AsCHS1)启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定

利用染色体步移法克隆了白木香查尔酮合成酶基因(As CHS1)ATG上游1 082 bp的启动子序列,该启动子序列中AT含量高达69.03%,符合真核生物启动子的序列特征。通过启动子预测软件分析可知,该序列的转录起始位点位于翻译起始位点-65 bp处,并且其上游-25~30 bp区域存在TATA-box等典型的真核生物启动子核心元件,同时含有一些顺式作用元件如赤霉素应答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif、水杨酸应答元件TCA-element等激素调控元件,光应答元件BoxⅠ、G-Box、ACE,厌氧诱导元件ARE等。通过构建p C-1 082pro As CHS1植物表达载体,借助农杆菌将重组载体转化到烟草叶片中。蛋白定量结果表明,该序列可以驱动GUS的表达,具有启动子活性;脱落酸显著增强该启动子的活性,乙烯则显著抑制该启动子的活性。     

水稻OsWRKY89基因启动子的表达特性

利用PCR技术从粳稻品种秀水11中扩增了转录因子WRKY89编码区5′上游大小为1470 bp的调控序列,命名为OsW89p,将它与GUS基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法将载体转化水稻,GUS组织化学分析结果表明,OsW89p驱动的GUS基因在转基因植株各个时期的叶、茎和叶鞘中均有表达;在花器的外稃和花药中有活性而在花粉和成熟种子中均无活性;种子萌发时在胚中有活性;2.5叶期时在种子根、不定根和侧根中均有活性但根尖中无活性,5叶期时根部只有侧根中有活性。分析了GUS在T1代苗期时的诱导表达特性,GUS荧光测定结果表明：1) GUS的表达被茉莉酸甲酯增强,诱导倍数是4.0,被2,4 D抑制,水杨酸对OsW89p的表达几乎没有影响;2) 用NaCl和PEG这2种非生物因子处理转基因苗根部,根中GUS的表达被抑制,但叶片中可被诱导增强;3) GUS的表达可被紫外线照射、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理这4种非生物逆境因子增强,其中以紫外线照射处理的诱导倍数最高。     

小麦 DA1基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

泛素受体DA1在控制种子和器官大小上发挥着重要作用。本研究以中国春小麦为材料,采用生物信息学的方法对小麦 DA1基因家族成员进行了全基因组鉴定和分析,共鉴定到12个小麦 DA1同源基因（ TaDA1s）,分别位于2B、2D、4A、4B、4D、5A、5B和5D染色体上,亚细胞定位预测结果表明其位于细胞核中。系统进化分析发现, TaDA1s可分为 TaDA1、 TaDAR1和 TaDAR2三类。除TaDA1-2D1编码的蛋白只含有DA1-like结构域外,其他成员编码的蛋白均含有DA1-like、UIM和LIM结构域。启动子序列分析发现, TaDA1s的启动子区含有较多的响应激素、逆境以及与生长发育相关的顺式作用元件。通过公共的转录组数据和qRT-PCR试验验证, 发现 TaDA1s在不同组织中都有表达,在籽粒发育过程中,不同的小麦 DA1基因呈现不同的表达模式,暗示存在基因功能分化现象;脱落酸（ABA）能够抑制 TaDA1s的表达;在低温和盐胁迫条件下, TaDA1s基因表达有明显的差异。酵母双杂交和荧光素酶互补试验发现,TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2存在转录自激活现象,且TaDAR1-5A与TaGW2有微弱的互作效应。本研究结果为进一步探究 DA1基因家族在小麦中的生物学功能奠定了基础。     

DAC对玉米DNA甲基化影响及基因表达量变化的研究

以5-氮杂-2脱氧胞苷(DAC)处理相应对照玉米幼苗叶片为材料构建转录组测序文库,采用Illumina测序平台进行测序,对差异表达基因进行GO功能分类和KEGG通路分析.最终筛选到差异基因1072个,其中,上调表达基因为646个,下调表达基因为426个.将差异基因富集的生物过程和信号通路进行GO分析,发现主要集中于细胞...     

A Novel Mutation in the Aprataxin (APTX) Gene in an Iranian Individual Suffering Early-Onset Ataxia with Oculomotor Apraxia Type 1(AOA1) Disease

Background

Ataxia with oculomotor apraxia type 1 (AOA1) shows early onset with autosomal recessive inheritance and is caused by a mutation in the aprataxin (APTX) gene encoding for the APTX protein.

Methods

In this study, a 7-year-old girl born of a first-cousin consanguineous marriage was described with early-onset progressive ataxia and AOA, with increased cholesterol concentration and decreased albumin concentration in serum. PCR and direct DNA sequencing was performed after DNA extraction.

Results

Sequencing analysis revealed a novel homozygous deletion in c.643 and A>T single nucleotide polymorphism in c.641 in exon 6 of the APTX gene [ENST00000379825].

Conclusion

It seems that this region of exon 6 is probably a hot spot; however, no deletions have been reported in exon 6 yet. Key Words: Ataxia oculomotor apraxia 1 (AOA1), aprataxin (APTX), Iranian     

粘类小麦雄性不育基因rfv1定向导入的研究

为了研究粘类非1BL/1RS小麦雄性不育基因rfv1定向导入的途径与方法,从而创制粘类非1BL/1RS小麦雄性不育系的新保持系,以非1BL/1RS普通小麦变种莫迦小麦为供体材料,综合农艺性状优良的1BL/1RS易位系(普通小麦品种)西农Fp1为受体材料,采用定向回交置换方法,同时结合根尖染色体镜检和SDS-PAGE检测,将莫迦小麦核基因组中的rfv1不育基因定向导入到西农Fp1的核基因组,完成育性染色体的专一替换,育成既携有来自莫迦小麦核基因组的rfv1不育基因,又具有西农Fp1核背景的粘类非1BL/1RS小麦雄性不育系的新保持系.该方法为杂种优势利用中更好地发挥粘类小麦雄性不育系的实际作用奠定了坚实的技术支撑.     

粘类小麦雄性不育基因rfv1定向导入的研究

为了研究粘类非1BL／1RS小麦雄性不育基因rfv1定向导入的途径与方法,从而创制粘类非1BL／1RS小麦雄性不育系的新保持系,以非1BL／1RS普通小麦变种莫迦小麦为供体材料,综合农艺性状优良的1BL／1RS易位系（普通小麦品种）西农Fp1为受体材料,采用定向回交置换方法,同时结合根尖染色体镜检和SDS-PAGE检测,将莫迦小麦核基因组中的rfv1不育基因定向导入到西农Fp1的核基因组,完成育性染色体的专一替换,育成既携有来自莫迦小麦核基因组的rfv1不育基因,又具有西农Fp1核背景的粘类非1BL／1RS小麦雄性不育系的新保持系。该方法为杂种优势利用中更好地发挥粘类小麦雄性不育系的实际作用奠定了坚实的技术支撑。     

大豆GmPR10基因启动子的克隆及序列分析

GmPR10基因是病程相关蛋白PR10(pathogenesis-related proteins 10)在大豆中的同源基因。为探明大豆GmPR10基因的表达调控规律,应用PCR技术从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号中克隆了GmPR10基因上游2 235 bp的启动子序列pGmPR10,定向替换pBI121载体的CaMV35S组成型启动子,构建植物表达载体pBI121/pGmPR10/GUS,并转化农杆菌侵染烟草叶盘。GUS染色结果表明,pGmPR10受聚乙二醇(PEG)、低温(4℃)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和脱落酸(ABA)诱导表达,因此推测GmPR10基因可能参与植物激素调节植物生长发育的过程,以及生物胁迫和非生物胁迫条件下植物对环境响应的过程。此外,利用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析pGmPR10,结果表明:pGmPR10含有启动子的一般结构TATA-box和CAAT-box,光应答元件,生长素和细胞分裂素响应元件,热激元件,低温应答元件,干旱应答元件以及ABA、SA、JA应答元件等。     

GmAGL15基因启动子的克隆及序列分析

为探明大豆CanAGL15基因的表达调控规律,应用电子克隆技术从大豆基因组中克隆了CanAGL15 1000 bp的启动子序列,用PLACE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的一般结构,如TATA-BOX、CAAT-BOX.另外还含有一些顺式作用元件,如调控GmAGL15的组织特异的和特定发育阶段的表达,对胁迫的应答,对光的响应,以及反馈调节,推测大豆GmAGL15基因表达有相应组织特异性,可能受蔗糖、生长素和乙烯等的调控.用FootPrinter和PLACE在线工具对大豆与拟南芥等其他4种植物的同源基因启动子的顺式元件进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了CanAGL15基因表达调控的精确性或多样性.     

Exon Sequencing of PKD1 Gene in an Iranian Patient with Autosomal-Dominant Polycystic Kidney Disease

Introduction: Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the most common genetic kidney disorders with the incidence of 1 in 1,000 births. ADPKD is genetically heterogeneous with two genes identified: PKD1 (16p13.3, 46 exons) and PKD2 (4q21, 15 exons). Eighty five percent of the patients with ADPKD have at least one mutation in the PKD1 gene. Genetic studies have demonstrated an important allelic variability among patients, but very few data are known about the genetic variation among Iranian populations. Methods: In this study, exon direct sequencing of PKD1 was performed in a seven-year old boy with ADPKD and in his parents. The patient’s father was ADPKD who was affected without any kidney dysfunction, and the patient’s mother was congenitally missing one kidney. Results: Molecular genetic testing found a mutation in all three members of this family. It was a missense mutation GTG>ATG at position 3057 in exon 25 of PKD1. On the other hand, two novel missense mutations were reported just in the 7-year-old boy: ACA>GCA found in exon 15 at codon 2241 and CAC>AAC found in exon 38 at codon 3710. For checking the pathogenicity of these mutations, exons 15, 25, and 38 of 50 unrelated normal cases were sequenced. Conclusion: our findings suggested that GTG>ATG is a polymorphism with high frequency (60%) as well as ACA>GCA and CAC>AAC are polymorphisms with frequencies of 14% and 22%, respectively in the population of Southwest Iran. Key Words: Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), Polycystic kidney diseases (PKD), PKD1 gene, Iran     

陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的启动子序列分析

为了筛选棉花耐盐转基因育种所需的诱导型候选启动子,本研究根据陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的cDNA序列和陆地棉基因组序列,获得陆地棉焦磷酸酶基因GhVP启动子序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该启动子具有多个基本元件TATA-box和CAAT-box,并含有多种逆境胁迫诱导相关的响应元件,含有丰富的光响应元件以及其他多种顺式作用元件。推测GhVP基因的转录同时受光、高温、干旱、创伤、脱落酸诱导,受生物钟控制的顺式元件调控,参与棉花的生长发育。     

野生木薯中蔗糖合酶基因I的启动子克隆与调控区域鉴定

克隆了野生木薯蔗糖合酶I基因的5′侧翼序列,发现其5′UTR区存在一个前导内含子,为了探究该基因启动子的调控区域以及前导内含子的可能功能,构建了6个侧翼序列梯度缺失载体并转化烟草。结果表明:野生木薯蔗糖合酶I基因的前导内含子可单独起始基因的转录,部分启动子序列的缺失会对基因的转录活性产生较大影响;不同缺失载体烟草转化株响应ABA的程度和方向存在差异,可能与ABA响应相关顺式作用元件的分布以及启动子序列与前导内含子的互作相关。该结果将会对木薯蔗糖合酶I基因的遗传改良提供理论指导。     

Patatin启动子驱动的人胰岛素原基因的植物表达载体的构建

使用马铃薯的偏爱密码子设计合成人胰岛素原基因,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,构建由patatin启动子调控的人胰岛素原基因植物表达载体p1301Ph,并将导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为日后转基因工作奠定了基础。     

铁皮石斛DoAGL6基因及启动子克隆与分析

AGL6基因是MADS-box转录因子家族中的一员,是植物特有的转录调控因子,参与花器官形成,对唇瓣的形成起到关键作用。获得铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并进行生物信息学分析,对DoAGL6基因启动子进行瞬时表达活性验证,可为进一步研究DoAGL6基因的功能提供参考。本研究克隆DoAGL6基因及其上游的启动子序列,利用在线软件对克隆得到的目的基因序列、启动子序列进行预测,分别构建由全长启动子和5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体并瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎,探究其表达活性。结果表明,成功克隆了DoAGL6基因及其启动子,DoAGL6基因编码区长729 bp,编码243个氨基酸,编码蛋白分子式为C₁₂₁₃H₁₉₅₅N₃₅₉O₃₇₅S₁₂,预测亚细胞定位于细胞核中;保守结构域分析表明,DoAGL6具有保守的MADS-box和K-box两个结构域,属于MADS基因家族MIKC亚家族。启动子序列长度为1891 bp,顺式作用元件分析结果显示,DoAGL6基因启动子中除了核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还有许多其他顺式作用元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、光反应顺式调节元件（G-Box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、MADS-box蛋白结合位点（GArG-Box）等。成功构建融合表达载体pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS,拟南芥和铁皮石斛原球茎瞬时转化及GUS组织化学染色结果表明,随着启动子5'端缺失片段的增长,GUS活性逐渐降低,启动子活性逐渐减弱,即全长启动子A1（-1891~1）的活性最强,5'端缺失片段A2（-1488~1）次之,A3（-784~1）活性最弱。瞬时转化后的拟南芥和铁皮石斛原球茎GUS染色均呈现蓝色,但与对照相比均较浅,说明全长启动子和2个5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。     

茶树CsANS基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

采用RACE技术,获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶(ANS)基因的c DNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明,Cs ANS全长c DNA为1 000 bp,其中ORF(Open Reading Frame)为957 bp,编码320个氨基酸,含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域;分离得到Cs ANS基因上游调控序列1 010bp,其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1(光响应元件)、circadian(生物钟相关元件)等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,该基因在全光照处理(CK)时表达量较高,75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。     

枇杷果实EjNADP-ME2基因及启动子克隆与表达分析

以‘解放钟’和‘白梨’果实为材料,研究基于转录组筛选出的表达量较高且在2个品种中有差异的EjNADP-ME2（Unigene0001461）基因,采用RACE和RT-PCR技术成功克隆EjNADP-ME2的cDNA全长。系统进化树分析表明,EjNADP-ME2与苹果的NADP-ME基因关系最近。生物信息学预测结果显示,EjNADP-ME2蛋白应该位于细胞质中。用染色体步移法成功克隆了EjNADP-ME2的启动子序列,序列预测该基因启动子区域含有水杨酸、茉莉酸、脱落酸响应的顺式作用元件,此外还有厌氧诱导元件、MYB和MYC参与黄化和干旱诱导的结合位点MBS。荧光定量PCR分析表明,EjNADP-ME2基因的表达量变化趋势在2个品种中大致相同,均呈现出先降低后升高又降低的趋势,且该基因在低酸品种的表达量稍低于高酸品种。相关性分析结果显示,低酸品种EjNADP-ME2基因转录水平与苹果酸含量呈显著负相关。本研究的结果为进一步探究EjNADP-ME2基因在苹果酸代谢途径中的功能奠定坚实基础。