Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry in Identification of Stallion Semen Bacterial Contamination

Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is one of the cutting-edge methods currently applied in medical bacteriologic diagnostics. The aim of the study was to prove the possibility of applying MALDI-TOF MS to identify bacterial contamination in the ejaculate of stud stallions, which may cause infections to reproductive organs of mares following artificial insemination with cooled semen. A partial aim was to determine changes in the total count of microorganisms in long-term storage of ejaculate after its treatment with gentamicin and also without antimicrobial medication. Aerobic cultivation on Columbia agar was used to examine 26 semen samples from 13 horses; 31 different species of bacteria were isolated, which were identified by MALDI-TOF MS. The most frequently detected species came from Aerococcaceae, Staphylococcaceae, and Micrococcaceae families. The results of our work confirm that MALDI-TOF MS is a quick alternative method for identifying bacterial species that may contaminate stallion semen.     

飞行时间质谱法检测水牛黑素皮质素受体4基因多态性

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)检测水牛黑素皮质素受体4(MC4R)基因的多态性(SNPs),为今后建立水牛辅助标记选择策略奠定基础。以水牛MC4R基因序列为模板,利用PCR扩增测序法筛查了水牛MC4R基因13个SNPs。为进一步验证筛选的可靠性,应用MALDI-TOF-MS针对380头水牛检测了8个标记的基因型。结果显示,平均检出率为98.0%,能够准确的检测出3种常见的基因型。所检SNP位点的平均最小等位基因频率(MAF)为0.24,平均杂合度为0.28,平均多态信息含量(PIC)为0.23。本研究建立的基于PCR测序法联合MALDI-TOF-MS检测水牛MC4R基因多态性的方法,具有快速、可靠和准确的特点,为今后开展水牛生产性状基因的SNP分型和检测等研究奠定了基础。     

Rapid Detection of SNPs in Buffalo MC4R Gene by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry

The study used matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) for rapid determination of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in buffalo MC4R gene,which provided a foundation for constructing the marker-assisted selection(MAS)strategy.The cDNA sequence of buffalo MC4R gene was screened rapidly based on PCR amplification and sequencing method,and in which 13 SNPs were found.To further identify the reliability of screening system,8 SNPs were genotyped in 380 buffaloes using the MALDI-TOF-MS technology.The results revealed that 8 SNPs had an average of 98.0% in call rate,and in which three genotypes could be accurately distinguished.The average minor allele frequency (MAF),average heterozygosity and polymorphism information content (PIC) value of the 8 markers was 0.24,0.28 and 0.23,respectively.Our findings indicated that the rapid determination method of MALDI-TOF-MS with PCR and sequencing with highly accurate properties was a useful tool for identifying the SNPs of buffalo MC4R gene that laid the foundations for studying SNP genotype in buffalo genes associated production traits.     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在动物病原菌检测中的应用

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术,对厦门口岸进口的1000多份动物及其产品的样品进行致病菌的检测和鉴定,共检出20多种致病菌,并对这些菌株同时用传统生化鉴定方法进行确认。结果表明MALDI-TOF-MS对未知细菌进行鉴定,较传统方法更加快速、准确,而且可以进行高通量检测,可以广泛应用于口岸动物检疫以及微生物检验实验室的日常检验。此外,将国内分离鉴定的各种参考菌株建立的常见致病菌MALDI-TOF-MS数据库与布鲁克公司的MALDI Biotyper数据库进行病原菌鉴定的比较,结果表明,实验室自建的MALDI-TOF-MS数据库可以取得更加准确地结果。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在动物源细菌耐药性监测中的研究应用

细菌鉴定是细菌耐药性监测过程中的重要工作环节之一,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time-off flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)能够高效鉴定细菌。为了快速监测五家养殖场来源的大肠杆菌和肠球菌的临床耐药特征,本研究利用MALDI-TOF MS和微量肉汤稀释法,快速鉴定临床分离的大肠杆菌和肠球菌,并对其进行耐药表型检测。结果显示,MALDI-TOF MS实现了对临床分离菌株(31株大肠杆菌和34株肠球菌)的快速鉴定;鸡源大肠杆菌和肠球菌的耐药情况最为严重,其次为羊和牛。其中,鸡源的大肠杆菌均对四环素(100%)和氨苄西林(91.67%)耐药率最高,肠球菌对苯唑西林(62.07%)耐药率较高。研究结果表明,不同动物源细菌临床耐药性表型严重程度有所不同,与此同时,MALDI-TOF MS技术可以同时实现对动物源大肠杆菌和肠球菌的快速鉴定,值得在动物源细菌耐药性检测领域推广应用。     

飞行时间质谱分析技术及其应用研究进展

阐述了飞行时间质谱分析技术的基本原理、仪器构成、性能特点,总结了飞行时间质谱分析技术的应用进展,并对这一技术的应用前景进行了展望。     

黑颈鹤源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

对黑颈鹤病原菌进行快速鉴定及毒力因子分析。采用16S rRNA序列分析法鉴定黑颈鹤病原菌,其毒力基因分别用大肠杆菌的irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR检测,并将扩增出来的irp2基因序列与Genbank~（TM）相应序列进行同源性分析。分离菌株鉴定为大肠埃希氏菌,鉴定结果与生化检测结果一致,分离菌携带irp2毒力基因,这从毒力试验得到证实,其序列与与Genbank~（TM）上发表的HPI irp2基因序列同源性高达98%以上。采用16S rRNA序列分析法可以对黑颈鹤大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,黑颈鹤源性大肠杆菌携带有irp2毒力基因。     

亲水作用色谱－电喷雾串联质谱法测定生鲜牛乳及奶粉中的双氰胺

建立了检测生鲜牛乳及奶粉中双氰胺的亲水作用色谱-电喷雾串联质谱(HILIC-ESI-MS/MS)分析方法.样品经乙腈提取后经亲水作用色谱柱分离,电喷雾串联四级杆质谱检测.结果显示,双氰胺标准曲线在0.5～100μg/L浓度范围内线性良好.相关系数(r)大于0.99;在5～50μg/kg添加水平下,回收率在80.1％～88.2％之间,相对标准偏差(RSD)均小于10％(n=6);方法操作简便、灵敏度高,适用于生鲜牛乳及奶粉中双氰胺的筛查及确证分析.     

犬肾（DK）传代细胞中霉形体的分离与鉴定

取经电镜观察证实有霉形体污染的ＤＫ传代细胞，分别接种于霉形体检验用液体、半流体和固体培养基，证明为霉形体混合感染，即该培养物在液体培养基和半流体培养基上，同时显示出水解精氨酸和发酵葡萄糖２种特性，前者使培养基ｐＨ上升，后者使ｐＨ下降。通过反复挑选单个菌落进行克隆传代和有目的地加入单一种属的霉形体抗血清的方法，将混合的２株霉形体纯化分开。经鉴定，一株为精氨酸霉形体，一株为莱氏无（需）胆甾醇霉形体。     

鸡滑液囊支原体的分离和鉴定研究

从河南某肉种鸡场疑似鸡滑液囊支原体感染的病鸡跗关节样品进行病原的分离与鉴定.分离菌经瑞氏染色,在油镜下呈球形或椭圆形.在固体培养基上表现为细小、光滑、致密的小菌落,菌落形态为“煎蛋状”.L型细菌鉴定发现菌体仍保持原有形态.菌体能够吸附红细胞,分解葡萄糖,但不能分解精氨酸和尿素,还可致SPF鸡胚死亡,说明该分离菌为支原体.进一步的血清学试验结果表明,该分离菌为鸡滑液囊支原体,而不是鸡毒支原体.根据已发表的鸡滑液囊支原体血凝素基因序列vlhA设计合成一对引物,经PCR扩增,该菌体能够扩增出鸡滑液囊支原体(773 bp)的特异性片段.人工感染试验结果显示,SPF鸡能够复制出自然病例.     

家蚕蚁蚕蛋白质组的质谱鉴定与数据库构建

为尝试构建基于质谱分析的家蚕蛋白质组数据库,采用一维电泳-液相色谱-质谱(1DE-LC-MS)技术对家蚕蚁蚕的蛋白质组进行了分析与鉴定。共检索到511个相匹配的候选蛋白质和92个多肽离子片段,鉴定获得了171个无冗余蛋白质组分,分别属于121种蛋白质或蛋白质亚基,其中有36种蛋白质或亚基尚未在家蚕及昆虫的基因与蛋白质数据库中报道;在171个被鉴定的蛋白质组分中,与细胞骨架和蛋白质代谢相关的组分多达64种。结果还表明,1DE-LC-MS技术也适用于从一维凝胶电泳的差异性条带及蛋白质混合样品中分离和鉴定特异蛋白质组分。     

鸡源致病性沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

通过对临床病死雏鸡的肝和心血处进行采样、分离、鉴定,获得13株致病性沙门氏菌。采用Kirby-Bauer法检测13株分离菌对10种抗菌药物的敏感性,结果表明,细菌对10种临床常用抗菌药物均表现出较高的耐药性,且均为两重或两重以上耐药,有的甚至达到对其中8种药物产生耐药性。13株分离菌对四环素的耐药率已高达100%,对复合磺胺、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、头孢唑啉和氯霉素的耐药率分别为92.3%、84.6%、84.6%、84.6%、69.2%、23.1%和7.7%;对庆大霉素和卡那霉素敏感。结果表明,沙门氏菌的耐药现象已十分严重。     

Identification and Serological Specificity of a Polysaccharide Component from Mycoplasma bovis

Whole-cell lysate and proteinase K digest preparations of the Mycoplasma bovis type strain (American Type Culture Collection 25523) were compared using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Coomassie blue staining for protein revealed approximately 50 bands for the lysate but only a single band for the digest. Silver staining for polysaccharide revealed at least 19 bands for the digest. Fourteen monoclonal antibodies (MAbs) were produced using a screening procedure with an M. bovis digest. On immunoblots of digests of four M. bovis strains, an almost identical profile was seen with each strain for all 14 MAbs but differences were evident between strains. One MAb, M1557, was used to analyse 17 M. bovis strains on immunoblots. Ten to 20 bands were observed with 16 of the 17 strains, and differences were apparent among all 16 strains. In an enzyme-linked immunosorbent assay, M1557 reacted with 16 of the 17 M. bovis strains, but did not react with any of 41 non-M. bovis organisms tested. Strong reactions were observed with the MAbs and M. bovis colonies in immunofluorescence. The M. boris polysaccharide and MAbs to this component may be useful for the development of diagnostic assays for this organism.     

桑突变体Cty-Ym叶片蛋白质的双向电泳及质谱分析

为探讨桑树叶色突变体CtyYm变异的分子机理,采用蛋白质组学分析技术,从突变体和对照桑中提取并分离叶片蛋白质,获得了IEF/SDSPAGE双向电泳图谱,在CBB染色条件下,检测到比较清晰的蛋白质点184个;经PDQuest软件分析,发现两者蛋白质点的相对含量有36处存在显著差异(±2倍),尤其是突变体中蛋白质点SSP2801的相对含量仅为对照桑的258%,经胶内酶切、LCESIQTOFMS分析、肽质量和碎片离子检索分析,鉴定该蛋白组分为RuBisCO大亚基,推测突变体CtyYm叶色黄化可能与RuBisCO大亚基含量减少有关。     

鸭疫里默氏菌的分离鉴定及免疫原性

自西安某鸭场病鸭中分离到 1株菌 ,经染色镜检、分离培养、生化试验、动物回归试验 ,鉴定为鸭疫里默氏菌 ;用分离菌株制作成油佐剂灭活疫苗 ,免疫 10日龄雏鸭 ,于免疫后 30 d用同源菌攻击 ,保护率为 83%(5 / 6 ) ,结果表明 ,本菌具有良好的免疫原性。     

急性临床型奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

本文对一起群发性急性临床型奶牛乳房炎进行了病原分离鉴定、致病性及药敏试验,结果表明该乳房炎是由金黄色葡萄球菌、停乳链球菌和铜绿假单胞菌混合感染引起,其中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对小鼠表现出较强的致病性,三株菌对兽医临床常用抗生素均表现出较强的耐药性。     

牦牛源干燥棒状杆菌的分离与鉴定

一只牦牛屠宰后肝有干酪样结节,为了探究其形成原因,本研究对该牦牛肝进行细菌的分离培养,对所分离可疑致病菌的16SrRNA以及rpoB基因序列进行扩增和序列分析,并用Vitek 2全自动微生物鉴定仪进行生化表型的鉴定,用K-B法进行药敏试验。结果显示,经细菌分离培养得到一株革兰阳性、棒状、可疑致病菌;其16S rRNA扩增片段大小1 483bp,GenBank序列编号为MH000696,该菌的16SrRNA与干燥棒状杆菌GD34株(KF928790.1)等的相似性最高,序列一致性为99%,系统进化树显示,本菌与干燥棒状杆菌在同一进化分支上;rpoB基因扩增片段大小434bp,GenBank序列编号为MH006608;Vitek 2全自动微生物鉴定仪鉴定为变异库克菌,可信度为93%。该菌对妥布霉素、氨曲南、头孢哌酮、米诺环素等多种药物高度敏感。综上所述,分离的细菌为干燥棒状杆菌,但基因序列,如rpoB等以及生化表型均存在一定程度的变异,本研究为兽医临床上该菌的分离和鉴定提供了依据,且为该菌的致病性研究奠定了基础。     

蛇代谢综合征继发感染细菌的分离鉴定及致病性试验

近年来,广西人工饲养的蛇发生代谢障碍综合征后,病死率较高,为查清原因,对临床接诊的18例蛇代谢障碍综合征病例的心、肝、脾等脏器病料进行细菌分离鉴定,并测定分离菌对小鼠和蛇的致病力。结果从18例病蛇的不同组织器官中分离到10株细菌,PCR结合生化试验方法,鉴定出4种细菌,分别为粪肠球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌和弗格森氏大肠埃希菌,并对其进行种系发育关系分析。所鉴定的4种细菌对昆明小鼠和蛇的致病力差异较大,克氏葡萄球菌和弗格森氏大肠埃希菌对昆明小鼠有较强致病性,粪肠球菌和缓慢葡萄球菌对昆明小鼠致病力较弱;克氏葡萄球菌对眼镜蛇有致病性,其余菌对王锦蛇、眼镜蛇、滑鼠蛇均无致病性。     

一株羊源尸毒梭菌的鉴定及生物学特性研究

为探究羊源尸毒梭菌的生物学基本特性,进行生理生化分析、16S rDNA基因扩增、动物回感试验、耐药表型和耐药基因检测等试验。结果显示,菌株LJH-1为革兰阳性菌。PCR扩增获得长度为1 023 bp的片段。LJH-1与尸毒梭菌C4菌株聚类,从而判定LJH-1为尸毒梭菌。试验组小鼠全部死亡。小鼠肝中央静脉充盈大量红细胞,炎性细胞浸润,肾间质血管充血,肠黏膜上皮细胞脱落。LJH-1对头孢噻肟、氨苄西林等敏感,对头孢拉定、阿莫西林等耐药,并检出ant（3″）-Ia、aac（3）-IIa、aph（3'）-IIa、Sul2、Sul3和TEM耐药基因。这为该细菌性疾病的检测和防治提供了科学资料。