铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析

[目的]克隆铁皮石斛中查尔酮合酶(CHS)基因,分析其基本生物学信息及组织表达特异性,为进一步研究CHS基因在铁皮石斛中的表达调控机理及其在铁皮石斛中的功能打下理论基础.[方法]采用铁皮石斛转录组序列与NCBI同源序列进行比对,根据保守区段设计引物克隆铁皮石斛CHS基因的cDNA全长,采用实时荧光定量PCR定量表达分析不同生长年限、不同组织部位中CHS基因的表达水平.[结果]铁皮石斛CHS基因cDNA编码区1188 bp,编码395个氨基酸,GenBank登录号KT783451,分子量为43.2 kD,理论等电点6.05.铁皮石斛GHS氨基酸序列与同属植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的CHS氨基酸序列同源性最高,达99%,与非同科植物欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis和紫玉兰(Magnolia liliiflora)等植物的同源性在83%左右.该基因编码的蛋白质属非分泌蛋白,定位于细胞质基质中,为非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白.CHS基因在1年生铁皮石斛叶片中的表达量最高,随着植株年龄的增长,叶片中CH基因的表达量降低,茎中的表达量升高.[结论]铁皮石斛CHS基因早期主要参与激素运输和器官形态建成,后期主要参与类黄酮物质合成.     

铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族鉴定及生物信息学分析

[目的]鉴定铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族成员,并进行生物信息学分析,为深入研究该家族在铁皮石斛热应激响应中的调控机制提供理论参考.[方法]以拟南芥和水稻Hsf蛋白氨基酸序列为参考序列,在铁皮石斛蛋白数据中搜索其同源蛋白序列,利用SMART和Pfam数据库鉴定出其Hsf基因家族成员.利用生物信息学方法对铁皮石斛Hsf基因家族组成、基因结构、启动子区顺式作用元件及其编码蛋白结构域和进化关系等进行分析.[结果]共鉴定获得23个铁皮石斛Hsf基因家族成员,编码氨基酸数量为132~514个,平均343个,多数属于酸性蛋白和亲水性蛋白,可分为HsfA、HsfB和HsfC组,其中HsfA组成员13个、HsfB组成员9个、HsfC组成员1个.除DoHsfA3仅包含motif 1和motif 2外,其他HsfA组蛋白均含有motif 1~motif 5,HsfB和HsfC组蛋白均缺少motif 5.铁皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亚类成员,与同属于单子叶兰科植物的小兰屿蝴蝶兰Hsf蛋白亲缘关系最近.HsfA组成员包含完整的HSF功能域和卷曲螺旋(CC)功能域,HsfB和HsfC组成员缺少或含不完整的CC功能域.DoHsfA1A蛋白具有保守的丝氨酸—苯丙氨酸—缬氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列.铁皮石斛Hsf基因启动子区含有大量激素响应、胁迫响应和生长相关元件.[结论]铁皮石斛Hsf基因家族成员进化较保守,其生物学功能存在明显物种特异性,进化关系较复杂,推测其在不同的非生物胁迫和植物激素信号途径中发挥潜在"节点"作用.     

柑橘Ptcor8基因相关功能的生物信息学分析

应用生物信息方法,对柑橘Ptcor8基因的理化性质、跨膜区域、疏水性/亲水性、二级结构、结构功能域、功能分类和同源性进行分析.结果表明:Ptcor8隶属于植物WCOR413冷诱导蛋白家族,具有1个621bp的潜在编码区,编码206个氨基酸残基;功能预测结果显示,Ptcor8编码蛋白质的相对分子质量为2.28×106,等...     

小麦Ta-UBXl基因的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得了1个小麦U - box蛋白基因Ta- UBXI,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析.结果表明:小麦Ta - UBXl基因全长2059 bp,具有完整的ORF编码框,编码553个氨基酸;在N端存在1个显著的UBX保守结构域,该蛋白序列不存在跨膜区或信号肽;生物信息学分析表明,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与其他禾本科植物的同类U - box蛋白具有高度的相似性.     

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为后期青天葵DXR基因的全长克隆、功能鉴定和调控研究奠定基础,采用生物信息学方法对前期通过转录组测序获得的青天葵DXR基因编码蛋白序列进行分析.结果表明:NfDXR序列包含457个氨基酸,分子量约为49.72 Ku,为亲水性、混合结构型蛋白质.NfDXR属于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶超级家族,含有DXR功能域、2个NAPDH结合基序和2个DXR活性位点基序,不具有跨膜结构域和信号肽结构.NfDXR与其他单子叶植物DXR同源性高,其中与铁皮石斛DXR的序列相似度达90％.     

暗纹东方鲀MyoD基因的克隆及生物信息学分析

提取暗纹东方鲀肌肉的总RNA,采用RT-PCR的方法来克隆暗纹东方鲀MyoD基因的cDNA序列,并通过生物信息学分析,对该基因所编码蛋白的理化性质、亲疏水性、亚细胞定位以及蛋白质结构等进行初步的分析和预测.结果显示,该基因编码区全长为846 bp,共编码了281个氨基酸,编码蛋白为亲水性非跨膜类蛋白,无信号肽结构,其亚细胞定位于细胞核中.系统进化树分析结果表明其与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近.     

柴达木盆地梭梭CMO基因的克隆及其蛋白结构预测

对柴达木盆地梭梭的CMO基因进行扩增,并利用生物软件对CMO基因序列进行分析、对蛋白结构进行预测。结果表明,柴达木盆地梭梭CMO基因长度为1 341 bp,编码447个氨基酸。CMO蛋白亲水性、二级结构、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋区、三级结构预测结果显示柴达木盆地梭梭CMO蛋白亚细胞定位于叶绿体,无信号肽,蛋白二级结构主要为无规则卷曲。CMO蛋白具有多个多种类型的功能位点,为蛋白功能的实现提供了保障。此外CMO蛋白的亲水性较强,无跨膜螺旋区。柴达木盆地梭梭CMO蛋白三维结构预测结果显示CMO蛋白三维结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲互相盘绕而成。     

茄子谷氨酸酯-1-半醛2,1氨基变位酶基因克隆和序列分析

基于茄子基因组数据库,以番茄同源基因序列为探针,通过电子克隆手段获得茄子谷氨酸酯-1-半醛2,1氨基变位酶基因,命名为SmGSA。对该基因编码蛋白从氨基酸组成、蛋白的各级结构及其理化性质等方面进行了预测和分析。结果表明,该基因包含一个长度为1 044 bp的开放阅读框,共编码347个氨基酸,蛋白质分子式预测为C_(3 137)H_(5 232 )N_(1 044)O_(1 322)S_(211),分子量大小为85.5 KDa,为亲水性蛋白;α-螺旋、延伸链和无规卷曲是该蛋白结构的主要构成元件;该蛋白中共存在9处跨膜区,内部到外部螺旋发现4个,外部到内部螺旋发现5个。     

青天葵DXR基因编码蛋白的生物信息学分析

为后期青天葵DXR基因的全长克隆、功能鉴定和调控研究奠定基础,采用生物信息学方法对前期通过转录组测序获得的青天葵DXR基因编码蛋白序列进行分析。结果表明:NfDXR序列包含457个氨基酸,分子量约为49.72Ku,为亲水性、混合结构型蛋白质。NfDXR属于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶超级家族,含有DXR功能域、2个NAPDH结合基序和2个DXR活性位点基序,不具有跨膜结构域和信号肽结构。NfDXR与其他单子叶植物DXR同源性高,其中与铁皮石斛DXR的序列相似度达90%。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

深绿木霉对青蒿的促生作用

为了研究深绿木霉对青蒿的促生作用,用深绿木霉菌丝体和孢子分别施用于苗期和成株期的青蒿,统计比较各项生长发育指标和生理指标.结果表明:与清水对照相比,深绿木霉菌丝体和孢子均能显著促进青蒿幼苗生长,但对大田成株青蒿没有显著促生作用.深绿木霉适合作为青蒿苗肥,部分替代化肥.     

芽孢杆菌拮抗镰孢菌机制的研究进展

镰孢菌（Fusarium）分泌多种真菌毒素引起的枯萎病、赤霉病、根腐病和穗腐病等植物病害,造成重大的作物生产损失。化学防治是防治镰孢菌的重要手段,但其带来的镰孢菌抗性和生态环境污染等问题,严重制约了农业可持续发展。在病害管理中使用生物防治剂为控制镰孢菌引起的植物病害提供了一种安全、有效和可持续的手段,因此生物防治具有比化学防治更深远的优势。在生物防治剂中使用最广泛的生防微生物是芽孢杆菌属（Bacillus）的成员,其可通过多种机制为植物提供有效控制镰孢菌入侵的方案。芽孢杆菌作为一种优良的生物防治剂已被广泛研究,其可通过生态位竞争、产生抗菌物质、诱导植物系统抗性和塑造根际健康微生物组来拮抗镰孢菌侵染,本文从以上4个方面对芽孢杆菌拮抗镰孢菌的机制进行综述,为农业生产中芽孢杆菌防治镰孢菌病害的研究提供参考。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

犬蠕形螨混合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的病原鉴定与诊治

为了对1例皮肤病患犬进行诊断和有效治疗。结合患犬临床症状，采用寄生虫学、血液学和微生物学等方法进行诊断检查，并进行对因和对症治疗。结果显示，经皮肤刮片和皮肤细胞学镜检，观察到犬蠕形螨；血常规和生化指标检查显示白细胞数和中性粒细胞数显著升高、总蛋白含量升高，表明患犬有严重慢性感染和炎症；细菌分离培养获得1株呈金黄色菌落的革兰氏阳性菌和1株呈乳白色菌落的革兰氏阴性菌，利用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；药敏试验结果显示2种细菌均对丁胺卡那霉素敏感，而对其他8种药物存在耐药差异；经选用多拉菌素抗犬蠕形螨治疗、丁胺卡那霉素抗菌治疗，结合对症治疗和提高犬体免疫力等综合治疗方法，连续治疗4周后，患犬病症消失，生理生化指标恢复正常，治疗效果明显。本治疗方法可为犬蠕形螨混合细菌感染的诊治提供参考。