滩羊肾和耳缘组织细胞的分离培养与鉴定

用胰蛋白酶热消化分离并培养肾组织原代细胞,组织块法培养耳缘组织原代细胞,并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存,细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查。结果发现,滩羊肾和耳缘细胞呈成纤维形,平均复苏活力94.5%和97.7%,生长均良好,生长曲线均呈"S",最大增殖浓度和倍增时间分别为2.8×105/mL、25.5 h和3.2×105/mL、24.2 h,保存的细胞经细菌、真菌、病毒和支原体检查为阴性,染色体为2n=54,二倍体占主体。本研究,滩羊肾和耳缘组织细胞成功分离培养并保存,使滩羊这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

贵德黑裘皮羊耳成纤维细胞系的建立和生物学特性的研究

以贵德黑裘皮羊耳缘组织为材料，采用组织块贴壁培养法和细胞冷冻技术成功构建了成纤维细胞系，并对培养细胞进行了形态学、生长动力学观察、细胞活力测定、核型分析和微生物检测。结果表明：细胞群体倍增时间（PDT）约为36h，冻存前细胞活力为96．2％，以DMEM／F-12＋20％FBS中添加10％DMSO冻存成纤维细胞，解冻后细胞活力为93．6％，24h后的贴壁率为85％。在传代10次之前，细胞染色体中二倍体（2n=54）占主体，约为82％～90％，细菌、真菌、病毒、支原体检测为阴性。该细胞系的建立，使贵德黑裘皮羊这一国家重要种质资源在细胞水平上保存下来，也为体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。     

敖汉细毛羊毛囊细胞系的建立及鉴定

为了研究敖汉细毛羊毛囊细胞的培养方法,建立敖汉细毛羊毛囊细胞系,保存毛囊细胞便于后续细胞水平毛囊相关基因的深入研究,试验采用胰蛋白酶消化法对初生40日龄以内的敖汉细毛羊皮肤组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存、复苏等方式成功分离并纯化出敖汉细毛羊毛囊细胞,然后对细胞进行了形态学观察,冻存、复苏活力检测,生长动力学分析,核型分析和微生物污染检测等分析。结果表明:原代毛囊细胞经胰蛋白酶消化及差速离心分离培养出毛囊细胞,冻存前细胞活力为94.19%,冻存1个月复苏后细胞活力为91.96%。细胞生长呈S型,经历潜伏期、指数生长期和平台期三个阶段。细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。试验成功分离了敖汉细毛羊毛囊细胞并建立了敖汉细毛羊毛囊细胞系。     

承德无角山羊耳成纤维细胞系的建立与冷冻保存研究

【目的】试验以甜菜碱作为冷冻保护剂对承德无角山羊耳成纤维细胞系进行冷冻保存，旨在优化冷冻保护效果，以期在细胞水平上长期保存这一地方品种家畜的遗传资源。【方法】采用组织块培养法建立承德无角山羊耳成纤维细胞系，利用甜菜碱作为冷冻保护剂对其进行玻璃化冷冻，以不同浓度(5%、10%、15%、20%及25%)甜菜碱为试验组，以不同浓度(10%和20%)二甲基亚砜(DMSO)为对照组，对承德无角山羊耳成纤维细胞进行冷冻，复苏后检测细胞的存活率、增殖活力以及细胞中B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)/Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因表达量，同时评估甜菜碱的毒性。【结果】本研究建立的承德无角山羊耳成纤维细胞系生长态势良好，细胞纯度较高，细菌、真菌和支原体3类微生物检测结果均为阴性，生长曲线呈S型，达到了建立成纤维细胞系的要求；当甜菜碱浓度为15%时细胞存活率最高，达90.86%,极显著高于对照组(P<0.01),细胞增殖活力及Bcl-2/Bax基因表达量均显著高于对照组(P<0.05),且甜菜碱的毒性远低于传统冷冻保护剂DMSO(P<0.05)。【结论】试验成功以甜菜碱作为单独的冷冻保...     

郏县红牛耳成纤维细胞的建立

以郏县红牛耳缘组织为试验材料,采用组织块贴壁法培养,成功建立郏县红牛成纤维细胞系,对其进行细胞形态、细胞活力、生长曲线、染色体核型分析及微生物检测等生物学特性研究。结果显示:细胞形态为典型的成纤维细胞,生长曲线呈S型,细胞倍增时间为39h,冻存前和细胞复苏后活力为98%以上;细胞染色体2n=60,细胞株1-P9、1-P14及2-P9二倍型比例为89.86%、73.82%、78.02%;细菌、真菌、病毒及支原体检查均为阴性。结果表明该细胞系的建立实现了郏县红牛遗传资源在细胞水平上的成功保存。     

新城疫病毒La Sota株的溶肿瘤性特性评估

试验通过检测病毒对癌性(Hep2C)和非癌性(MRC-5)细胞系的影响来确定NDV的溶肿瘤效率。用NDV La Sota株感染这些细胞系。在两个细胞系中都观察到了CPE,但是Hep2C细胞系发现严重的细胞损伤。在不同的时间间隔进行细胞计数,大约有98%的Hep2C细胞不能存活。95h后,仅有40%的MRC-5细胞没有活力,将这些细胞进行重新传代,发现仍然会有吸附现象出现。     

滩羊种质资源细胞库的构建及细胞的生物学鉴定

目的:通过对滩羊体细胞的体外分离培养和保存,在细胞水平上保存其种质资源。方法:用胰蛋白酶消化分离培养肾和睾丸组织的原代细胞,用组织块法培养耳缘组织的原代细胞,经传代扩大培养后在液氮中保存。细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性和微生物污染的检查。结果:滩羊肾、睾丸和耳缘组织的原代细胞生长良好,细胞冻存后复苏检查的细胞活力在91.12%~97.74%,细胞形态和长势良好,生长曲线呈近"S"型曲线,最大增殖浓度为在2.12~3.19×10~5/ml,倍增时间在24.62~28.1 h,细菌、真菌、支原体和病毒检查为阴性。结论:滩羊的种质资源细胞库成功构建,使这一物种的种质资源在细胞水平上得到保存。     

转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定

本研究旨在建立转双基因（pGH/IGF-Ⅰ）猪胎儿成纤维细胞系,保存转双基因猪的成纤维细胞以便于后续细胞水平研究。试验采用胰蛋白酶消化法对猪胎儿躯干组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功分离出转双基因猪胎儿成纤维细胞,并对细胞进行了形态学观察、冻存前和复苏后细胞活力检测、生长动力学分析、波形蛋白免疫组化及微生物污染检测等生物学特性分析。结果显示,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,冻存前细胞活力为94.3%,冻存3个月后细胞复苏后活力为91.2%;细胞生长总趋势呈“S”型,经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白在成纤维细胞中呈阳性反应;细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。结果表明本试验成功建立了转双基因猪成纤维细胞系。     

宁夏滩羊mtDNA Cyt b基因遗传多样性分析

为了分析宁夏滩羊线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b脱复辅基酶(Cytb)基因的遗传多样性,试验采用PCR扩增和基因测序的方法对线粒体Cyt b基因在宁夏地区3个绵羊品种(滩羊、小尾寒羊和蒙古羊)群体的遗传多样性进行检测,分析其碱基组成及序列间碱基的变异。结果表明:滩羊线粒体Cyt b基因部分序列长度为363 bp,A、C、G、T的平均含量分别为39.11%、19.84%、19.26%、21.79%,碱基组成的百分比显示,G相对缺乏,A+T平均含量(60.90%)比G+C(39.10%)平均含量高。在滩羊与蒙古羊、小尾寒羊品种间存在1个变异位点,在47位点处发生了A/G的转换,可以作为候选基因用于辅助检测。     

转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系的建立及鉴定

本试验采用组织块贴壁法对初生仔猪的耳组织进行原代培养,成功分离出转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞,并对细胞进行形态学观察,冻存前和复苏后细胞活力检测,生长动力学分析,波形蛋白免疫组化,染色体计数以及微生物污染检测等生物学特性分析。结果表明,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,7组细胞冻存前细胞活力均在为92%以上,冻存3个月后细胞复苏活力仍在89%以上;细胞生长总趋势呈"S"型,即经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白免疫组化在成纤维细胞中呈阳性反应;染色体计数结果表明,染色体数量稳定;成纤维细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。本试验成功建立了转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系。     

Investigation of the effects of deracoxib and piroxicam on the in vitro viability of osteosarcoma cells from dogs

OBJECTIVE: To determine whether exposure of canine osteosarcoma cells to deracoxib or piroxicam results in decreased viability, whether the cytotoxic effects of deracoxib and piroxicam involve induction of apoptosis, and whether deracoxib is a more potent inhibitor of osteosarcoma cell growth than piroxicam. SAMPLE POPULATION: 1 fibroblast and 3 osteosarcoma cell lines. PROCEDURE: Cell counts and viability assays were performed using osteosarcoma cells (POS, highly metastatic POS, and canine osteosarcoma cell 31) and fibroblasts after 72 hours of incubation with deracoxib at concentrations of 0.5 microM to 500 microM or piroxicam at concentrations of 1 microM to 1,000 microM. Percentage viability was determined for each concentration. A DNA fragmentation analysis was performed to assess drug-induced apoptosis. RESULTS: Concentration of deracoxib required for 50% inhibition of cell viability (IC50) was reached in all 3 osteosarcoma cell lines and ranged from 70 to 150 microM, whereas the IC50 for piroxicam was only reached in the POS cell line at 500 microM. Neither deracoxib nor piroxicam induced sufficient toxicity in fibroblasts to reach an IC50. Exposure of osteosarcoma cells to cytotoxic concentrations of deracoxib and piroxicam did not result in DNA fragmentation. CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: Intermediate and high concentrations of deracoxib and high concentrations of piroxicam were cytotoxic to osteosarcoma cells; neither drug inhibited cell viability at typical plasma concentrations in dogs. Deracoxib inhibited viability of cells at concentrations that did not affect fibroblast viability. There was no evidence of apoptosis induction for either drug; however, only 1 cell line was evaluated for apoptosis induction and only for a limited selection of drug concentrations.     

Cell lines derived from feline fibrosarcoma display unstable chromosomal aneuploidy and additionally centrosome number aberrations

The purpose of the study was to evaluate clonality and presence of numerical chromosomal and centrosomal aberrations in 5 established feline fibrosarcoma cell lines and in a fetal dermal fibroblast cell line as a control. The clonality of all cell lines was examined using limited-dilution cloning. The number of chromosomes was counted in metaphase spreads. The immunocytochemical analysis of centrosome numbers was performed by indirect immunofluorescence using a monoclonal antibody that targets γ-tubulin, a well-characterized component of centrosomes. Monoclonal cell populations could be established from all cell lines. In all feline fibrosarcoma cell lines, the number of chromosomes deviated abnormally from the normal feline chromosome number of 2n = 38, ranging from 19 to 155 chromosomes per cell. Centrosome hyperamplification was observed in all 5 feline fibrosarcoma cell lines with a proportion of cells (5.7 to 15.2%) having more than 2 centrosomes. In the control cell line, only 0.6% of the cells had more than 2 centrosomes. In conclusion, the examinations revealed that centrosome hyperamplification occurs in feline fibrosarcoma cell lines. The feline fibrosarcoma cell lines possessed 10 to 25 times as many cells with centrosome hyperamplification as the control cell line. These observations suggest an association of numerical centrosome aberrations with karyotype instability by increasing the frequency of chromosome missegregation. The results of this study may be helpful for further characterization of feline fibrosarcomas and may contribute to the knowledge of cytogenetic factors that may be important for the pathogenesis of feline fibrosarcomas.     

Establishment and Identification of a Fetal Fibroblast Cell Line with Double Transgenic (pGH/IGF-Ⅰ) Porcine

This study was aimed to establish a fetal fibroblast cell line of double transgenic (pGH/IGF-Ⅰ) pigs,and reserve fibroblast cells of double transgenic pigs for the follow-up study.A method of trypsin digestion was adopted to isolate and culture body tissues from pregnant porcine,and porcine fetal fibroblasts were isolated successfully through primary culture,subculturing and cryopreservation.The morphological observation,determination of viability before cryopreservation and after recovery,dynamic growth analysis,vimentin immunohistochemistry and microbial contamination detection were all done to study the biological characteristics of the cell line.The results showed that the fibroblasts were cultured and isolated successfully by trypsin digestion and differential centrifugation.The cell viability before cryopreservation and after recovery were 94.3% and 91.2%,respectively.The growth curve was sigmoidal,and experienced the incubation period,exponential growth period and platform three stages.The vimentin immunohistochemistry was positive,the microbial contamination detection were all negative.The results indicated that a fibroblast cell line of double transgenic porcine was successfully established.     

猞猁3类组织体外培养细胞的生物学特性分析

为研究体外培养猞猁细胞的生物学特性,深入开展猞猁基因组学及濒危野生动物保护工程,本试验获取猞猁不同组织细胞,用α-MEM培养液进行原代、传代培养,并对培养的细胞进行形态学观察、生长特性检测及核型分析。结果表明,猞猁不同组织细胞具有不同的生物学特性;心脏、躯体及睾丸来源的组织块分别在培养5~6、8~9、11~12 d时开始有成纤维样细胞从中长出,而在进行传代时,这3种组织来源的细胞生长速度没有表现出明显的差异,通常在4~5 d可铺满瓶底;核型分析结果表明,体外培养的猞猁细胞染色体数目为2n=38,为19对,其中18对为常染色体,1对为性染色体。上述结果可为今后猞猁不同组织细胞的深入研究提供试验材料和依据,也将为猞猁的细胞系构建提供参考。     

Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系，分析稳转细胞系的自噬水平和活力，为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体，转染至293T细胞，获得慢病毒颗粒，将病毒颗粒感染B16F10细胞，通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果，Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况，CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明，成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA，纯化的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1，建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制，mRNA的沉默效率约为75%（P<0.01），发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量，降低B16F10细胞活力。以上结果表明，干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性，促进B16F10细胞死亡，这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。     

岷县黑裘皮羊肾组织成纤维细胞系的建立及其生物学特性研究

采集岷县黑裘皮羊肾组织,用胰蛋白酶热消化法制备原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法进行继代培养和细胞纯化,并对复苏细胞的形态、活力、生长曲线、荧光蛋白质粒转染表达、核型以及乳酸脱氢酶同工酶等生物学特性进行了分析。结果显示:原代和传代细胞生长形态均好,群体倍增时间为28.3 h;染色体2 n=54,二倍体占主体(84%)乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱有明显特征,未见LDH4、LDH5谱带,与其它羊有明显区别;外源性荧光蛋白转染质粒在该细胞中能进行复制和表达;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性。表明该研究已成功建立岷县黑裘皮羊肾组织成纤维细胞系,为在细胞水平上保存岷县黑裘皮羊种质资源以及进行相关研究提供了理想的生物材料。     

六种哺乳动物细胞系染色体制片条件优化研究

为提高胞核学检验的检查效率,采用6种具有种属代表性的常用传代细胞系对影响检验的关键步骤(染色体制片条件)进行优化,并对这六种传代细胞系的染色体数目进行了统计。实验以CHO、BHK-21、ST、OA3.Ts、MDBK、RK-13六种疫苗生产中常用的传代细胞系作为材料,对影响染色体制片效果几个主要条件(秋水仙素浓度、KCl浓度及低渗处理时间)进行了优化,并对这六种细胞染色体数目分布进行了检查。结果发现,在细胞用25 cm~2细胞培养瓶1∶2比例传代24～48 h时,秋水仙素浓度为1μg/mL,处理60 min后处在中期分裂相的细胞最多,视野中染色体长度适中;用0.4%KCl溶液低渗处理40 min,细胞中染色体在载玻片上形态最佳,分散度最好。优化后的染色体制片条件,可适用于多种细胞的染色体制片,结果重复性好,染色体形态和分散度均满足胞核学检验要求,可为胞核学检验的流程标准化制定提供有益参考。     

水牛卵巢颗粒细胞的分离培养及凋亡测定

研究主要是通过比较水牛卵巢颗粒细胞在不同培养基中的生长状态,并对细胞的增殖、核型及凋亡情况进行检测,以了解水牛卵巢颗粒细胞体外生长特性,建立水牛卵巢颗粒细胞的体外培养体系。结果发现,分离获得的水牛卵巢颗粒细胞存活率约为60%;采用DMEM培养基,颗粒细胞的生长速度和生长状态优于TCM-199和DMEM/F12培养基;细胞培养24 h后开始零星增殖,3~5 d增殖速度达到高峰;第1、3、5、7代颗粒细胞正常核型比率差异不显著,均在85%以上;第1代颗粒细胞的凋亡率与第5代差异显著(P<0.05),与第7代差异极显著(P<0.01)。结果表明,DMEM培养基更适宜用于水牛颗粒细胞的体外培养;水牛颗粒细胞能稳定地进行传代培养,染色体的数目不会发生明显改变,但细胞凋亡率会随着培养代数的增加而明显升高。