细粒棘球蚴Eg95s基因的串联表达及表达系统优化

为研制新型棘球蚴病基因工程疫苗,根据GenBank公布的细粒棘球蚴Eg95基因序列,针对其中一段348 bp高度亲水的优势表位序列设计引物,扩增Eg95s基因,利用同尾酶法基因同向串联方案,获得3拷贝Eg95s串联体。分别用两种表达载体pGEX-6p-1和pET-32a构建重组质粒,转化入3种大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、Rosseta(DE3)和Origami (DE3),对其进行IPTG诱导表达,经免疫印迹分析结果表明,均能正确表达具有免疫原性的Eg95s蛋白。通过重组蛋白的表达量、可溶性、纯化方法等方面的比较,对Eg95s重组表达系统的载体及宿主菌进行了优化,结果表明,3拷贝的串联Eg95s在以pET-32a为表达载体,Rosseta(DE3)为宿主菌的系统中表达最佳。最终获得了表达量高、可溶性好、纯化方便的Eg95s重组蛋白表达系统,为大规模生产棘球蚴病基因工程疫苗提供了科学依据。     

细粒棘球绦虫G1型Eg95基因的原核表达及蛋白鉴定

根据GenBank发表的细粒棘球绦虫G1型Eg95序列合成Eg95抗原基因(HM345604.1),设计并合成一对引物,采用PCR技术扩增Eg95抗原基因,亚克隆到pET-28a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,Eg95抗原蛋白可以在大肠埃希菌中高效表达,表达重组蛋白的分子质量约为16.5ku。Western blot结果表明,该蛋白可与阳性血清发生特异反应,具有很好的反应原性。     

猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达及鉴定

为获得大量的猪瘟病毒重组蛋白抗原,本文构建了猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域原核重组表达质粒pET-32a(+)-ABCD,对该重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达产量进行了比较分析,并采用胶体金免疫层析和蛋白质免疫印迹鉴定重组蛋白的反应原性。结果表明重组质粒pET-32a(+)-ABCD在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中均可以获得可溶性表达,目的蛋白表达量分别占总蛋白量的比例为11.4%和19.7%,大肠杆菌Rosseta(DE3)作为表达宿主菌更高效,且重组蛋白具有反应原性。该研究为猪瘟病毒重组蛋白抗原的制备提供了参考。     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础.将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定.同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测.结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性.同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性.EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础.     

不同类型CpG基序对细粒棘球蚴Eg95抗原的免疫增强作用研究

为探究不同类型CpG基序对细粒棘球蚴（Echinococus granulosus）Eg95抗原的免疫增强作用,将pET-32a-3Eg95重组大肠杆菌,经IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白pET-32a-3Eg95。将重组蛋白分别与常规佐剂Quli-A、pUC18-CpG和CpG ODN混合制备基因工程亚单位疫苗样品,免疫小鼠。通过间接ELISA方法检测抗体水平,通过实时荧光定量PCR方法测定体外刺激试验后细胞因子的相对表达量,检测不同佐剂在体液免疫和细胞免疫方面对Eg95抗原免疫效果的增强作用。结果显示,诱导表达重组蛋白的大小约为56 ku,与理论值相符,用羊细粒棘球蚴阳性血清检测有特异性条带;pUC18-CpG组和CpG ODN组小鼠免疫后14、28、42 d的抗体平均水平（D_{450 nm}）分别为3.10、3.03、3.22和2.98、3.12、3.27,与Quli-A组抗体平均水平相比均差异显著（P<0.05）;CpG ODN组血清中抗体平均水平略高于pUC18-CpG组,但差异不显著（P>0.05）。重组蛋白刺激后pUC18-CpG组与CpG ODN组IFN-β、IFN-γ和TNF-α的相对表达量分别为6.88、2.35、6.28和5.03、2.85、7.07,与Quli-A组相比差异均显著（P<0.05）。因此相对于常规佐剂Quli-A,pUC18-CpG和CpG ODN在体液免疫和细胞免疫方面对Eg95抗原都有显著的免疫增强作用,CpG ODN的免疫增强作用略优于pUC18-CpG,二者均可作为免疫佐剂,增强现有包虫病基因工程疫苗抗原的免疫效果。     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95- (C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。     

不同表达条件对Eimeria tenella丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响

为探讨不同原核表达载体、不同表达温度对重组表达Eimeria tenella丙二酸单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响,以生物信息学技术预测的E.tenellaⅡ型脂肪酸合成代谢途径中的丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶(Et-MCAT)编码序列为基础,分别设计引物扩增完整ORF,采取截除信号肽而保留转导肽以及切除信号肽和转导肽的不同策略,选择pMAL-c2x、pET-32a(+)和pProExHTa3种不同表达载体分别构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)后,在不同条件下诱导表达,利用酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性,以评价不同表达策略对表达效果和表达产物活性的影响。表达水平和酶活性分析结果显示,惟切除信号肽和转导肽后的功能蛋白编码区能表达,Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mcat体系的可溶性表达量高于Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-mcat,但二者表达产物的酶活性相似,且均随着诱导温度的降低其可溶性蛋白表达量增加。但Rosseta(DE3)/pProExHTa-mcat体系仅能表达不溶性蛋白,且复性后无酶活性,改变诱导温度对表达效果无明显影响。结果表明不同表达载体和诱导温度对大肠杆菌所表达EtMCAT的活性及其表达形式有显著影响,其中融合标签和表达温度可能是主要的影响因素,包涵体表达的重组酶即使复性处理仍难达到酶活性分析的要求。     

巨型艾美耳球虫配子体蛋白EmGAM56的原核表达及其抗原性鉴定

本研究将巨型艾美耳球虫Emgam56基因去除信号肽后的ORF序列连接至pET-28a(+)载体,构建表达载体pET-28-Emgam56,转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达;分析表达产物的可溶性和重组蛋白的分子相对质量,并进一步鉴定重组配子体蛋白rEmGAM56的抗原性。SDS-PAGE分析表明,表达载体能表达56000左右蛋白质,主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blot检测表明,rEmGAM56蛋白能被鼠抗rEmGam56多克隆抗体和巨型艾美耳球虫感染鸡的康复血清特异性识别,显示重组蛋白具有良好的抗原性。本研究结果为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定了基础。     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

将含有鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因的重组转座载体PFF转染昆虫细胞sf9,28℃培养,待细胞出现明显病变后,收取细胞,反复冻融,接种sf9昆虫细胞,如此再传代1次,收集细胞保留毒种,同时做表达产物的检测,结果表明,表达产物约占细胞总蛋白的10%,并有良好的反应原性。     

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础.     

结核分支杆菌MPT83在真核、原核表达载体中的克隆、表达与鉴定

为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达载体 p JW43 0 3和p ET2 2 b( )中 ,构成重组真、原核表达载体 83eu和 MPT83。经酶切和序列鉴定为正确的重组真核表达载体 83 eu和重组原核表达载体MPT83 ,分别转染 COS7细胞和转化 BL2 1( DE3 ) plys S。结果表明 ,经 SDS-PAGE、Westernblotting检测显示 ,IPTG诱导的原核表达载体MPT83在 2 .6万处有正确而特异的蛋白条带 ;转染 COS7细胞的真核表达载体 83 eu,Westernblotting检测表明也有与结核分支杆菌抗血清特异反应的蛋白条带     

RNAi表达载体对avUCP基因表达的抑制作用

研究RNA干扰（RNA interference,RNAi）表达载体对UCP基因的抑制作用。针对鸡解耦联蛋白（avianuncoupling protein,av UCP）基因,构建4种RNAi质粒表达载体（分别称为A、B、C和D号载体）。再经过脂质体法转染成肌纤维细胞,应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对av UCP mRNA及蛋白表达的影响。构建的4种表达载体均抑制了av UCP的mRNA及蛋白的表达,其中转染C号载体的成肌纤维细胞av UCPmRNA表达相当于空白对照组的14.6%,蛋白抑制率达93.7%。RNAi表达载体可以有效的抑制avUCP基因的表达。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。     

猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞