美仁牦牛ILK基因克隆及生物信息学分析

为探究美仁牦牛ILK基因的结构与功能,利用PCR技术克隆了美仁牦牛背最长肌ILK基因CDS区序列,并利用在线软件预测和分析其编码氨基酸序列的生物信息学特征。结果表明,美仁牦牛ILK基因编码区长度1 359 bp,共编码452个氨基酸,是一种主要在细胞质中发挥生物学功能的亲水性蛋白;美仁牦牛ILK基因编码蛋白分子式C₂₂₇₆H₃₅₈₀N₆₅₆O₆₄₇S₃₀,分子量51 447.27 Da,原子总数7 189,理论等电点8.30,不稳定性指数41.47,共有27个磷酸化位点;同时,亚细胞定位结果表明,美仁牦牛ILK基因主要分布在细胞质中;系统进化树表明,美仁牦牛与野牦牛和普通牛亲缘关系最近,与非洲爪蟾亲缘关系最远。     

牦牛死亡结构域蛋白(FADD)基因克隆与生物信息学分析

死亡结构域蛋白(FADD)是在生物细胞里起到信号转导作用的一种蛋白,在胚胎发育、细胞凋亡过程中发挥重要的生物学活性。实验以成年母牦牛的卵巢RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆牦牛FADD基因,并进行了生物信息学分析。结果表明:牦牛FADD基因CDS区长度630 bp,编码209个氨基酸,蛋白分子式C996H1632N300O307S7,整个蛋白质带负电荷,总共原子数量3 242;分子质量23.0 ku,半衰期30 h;理论等电点6.11;消光系数18 240;不稳定指数49.08,属于不稳定蛋白;脂肪系数104.64,平均亲水系数-0.168,预测FADD蛋白为亲水蛋白。系统进化树表明,牦牛与哺乳动物亲缘关系近,与鱼亲缘关系最远,符合物种进化规律。FADD蛋白质的二级结构α螺旋、自由卷曲、β-转角和延伸链,占靶蛋白的比例分别为71.29%、22.97%、3.83%和1.91%,与三级结构相符。牦牛FADD蛋白有13.0%位于细胞核、52.2%位于细胞质、8.7%位于细胞外、13.0%位于线粒体、4.3%位于高尔基体和8.7%位于细胞骨架。该研究成功克隆出牦牛FADD基因CDS区,为进一步研究其功能提供了一定理论依据。     

牦牛Myf6基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在克隆牦牛Myf6基因,进行生物信息学分析并探究其在牦牛不同时期的表达情况。以青海雪多牦牛为研究对象,通过设计引物对其Myf6基因CDS区进行克隆测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测研究。结果显示,牦牛Myf6基因含有一个大小为729 bp的开放阅读框（ORF）,编码242个氨基酸。同源性比对和进化树分析结果表明,牦牛Myf6氨基酸序列与普通牛、绵羊亲缘性最近。对Myf6蛋白理化性质进行预测分析得到其结构式为C₁₁₆₇H₁₈₇₀N₃₃₆O₃₇₂S₁₃,理论等电点为5.64,其中丝氨酸含量最高,其次是亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸;其疏水平均值为-0.586,亲水性最强为-2.467,疏水性最强为1.511,为亲水性、可溶性蛋白;有可形成卷曲螺旋部位;磷酸化位点预测其有26个丝氨酸激酶,10个苏氨酸激酶,5个酪氨酸激酶;亚细胞定位分析其编码产物在细胞核中分布最多（73.9%）,其次为细胞骨架（13.0%）、细胞质（4.3%）、高尔基体（4.3%）、分泌系统小泡（4.3%）。蛋白质二级结构主要由无规则卷曲（49.17%）组成,其次是α-螺旋（33.47%）、延伸连（11.57%）及β-折叠（5.79%）。蛋白功能分析显示其生长因子功能几率较大（7.694）,其次为转录调节作用,预测其作为一种生长因子参与机体生物学调控。实时荧光定量PCR结果显示,Myf6基因在胎牛、6月龄、4~5岁牦牛背最长肌中均有表达,且在6月龄的表达量显著高于胎牛和4~5岁牦牛（P<0.05）。上述结果为研究牦牛Myf6生肌因子提供了重要的研究数据,为改良牦牛经济性状提供了参考。     

西藏牦牛HBG基因克隆及生物信息学分析

为探究血红蛋白γ珠蛋白在适应高海拔低氧环境中的作用及其高氧亲和力机制,研究采用克隆技术获得血红蛋白γ珠蛋白(HBG)的基因序列,并对其CDs区序列进行相关生物信息学分析。结果表明,西藏牦牛HBG基因CDs区长438 bp,序列与普通牛一致,在种间具有较强的保守性。HBG编码145个氨基酸,密码子使用具有一定偏好性;HBG蛋白无跨膜区、信号肽,存在多个磷酸化位点;整条肽链表现出亲水性,为可溶性蛋白;预测HBG蛋白的二级结构和三级结构,以α-螺旋为主。     

牦牛MT-IV基因克隆与序列分析

采用RT-PCR方法,利用特异性引物YMT-IVSP1和YMT-IVSP2先克隆出牦牛Bos grunniens MT-IV的编码区序列全长,将其与人MT-IV基因全序列比对,设计2对引物分别克隆内含子1和内含子2,将获得序列拼接后得到了牦牛MT-IV外显子与内含子全长为2 099 bp（GenBank Accession No.:EU665491）,编码区序列长189 bp,编码62个氨基酸,20个半胱氨酸残基,不含芳香族氨基酸,2个内含子的长度分别为1 392和518 bp。将牦牛MT-IV基因编码区序列和氨基酸序列BLAST搜索结果表明,MT-IV在物种间高度保守。牦牛MT-IV氨基酸序列与牛、绵羊、山羊、狗、家鼠、人和马的比对表明,MT-IV包含有金属硫蛋白（MTs）特有的C-X-C、C-C-X-C-C、C-X-X-C 结构域,构建的系统发育树与比较生理学和形态学相同,表明牦牛MT-IV具有与其他哺乳动物相同的分子特性,有必要进行牦牛MT-IV在上皮细胞中表达量水平的研究。     

金川牦牛BCL2A1基因克隆及生物信息学分析

为探讨金川牦牛抗凋亡因子--B淋巴细胞瘤2相关蛋白A1（B cell lymphoma 2 related A1,BCL2A1）基因特点,本试验采用PCR方法以金川牦牛血液DNA为模板扩增BCL2A1基因,用DNAStar、ExPASy、ABCpred等生物信息学软件分析基因序列和蛋白质结构。结果显示,克隆获得的片段长622 bp,GenBank登录号：MG459158,开放阅读框为516 bp,共编码171个氨基酸,其中缬氨酸（V）、赖氨酸（K）的含量较多,分别为9.4%和8.8%。BCL2A1分子质量为19.46 ku,理论等电点为4.99,不稳定系数为17.44,具有跨膜螺旋结构域（Scores>500）。二级结构主要为α-螺旋,占60.82%,有一个BCL2结构域,三级结构模型与人BCL2A1同源性最高（72.79%）,BCL2A1存在潜在的B细胞抗原表位。与野牦牛氨基酸序列进行比对显示,金川耗牛BCL2A1存在5个氨基酸差异位点。NJ法系统进化分析显示,金川牦牛与野牦牛同源性为98.5%,亲缘关系最近。本试验成功克隆了金川牦牛BCL2A1基因,其在哺乳动物中具有较高的保守性,为深入研究牦牛BCL2A1基因功能提供理论依据。     

类乌齐牦牛SIRT3基因克隆与生物信息学及差异表达分析

本实验旨在丰富牦牛 SIRT3基因的基础研究,通过对西藏类乌齐牦牛 SIRT3基因克隆、生物信息学分析及差异表达分析,进一步探讨 SIRT3基因的生理功能及分子机制。结果表明:类乌齐牦牛 SIRT3基因CDS区长 1 002 bp,编码 333个氨基酸,与普通牛 SIRT3基因 CDS区比对存在碱基突变,编码氨基酸发生错义和同义突变,同义突变发生在碱基第 49、279、342、384 位,错义突变发生在碱基第 149 和 620 位,其编码蛋白属亲水性蛋白,有多个跨膜区域和磷酸化位点,无信号肽片段,主要位于线粒体,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主;SIRT3基因编码蛋白在催化活性、核苷酸结合及辅因子结合等过程发挥主要功能,主要参与生物体代谢过程;类乌齐牦牛 SIRT3基因序列与普通牛一致性较高,亲缘关系最近;QPCR分析显示,SIRT3基因在牦牛肝脏中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。     

青海高原牦牛PRDM1基因克隆及生物信息学与差异表达分析

以青海高原牦牛淋巴结,90日龄胎儿头部皮肤,牦牛精子以及西门塔尔牛精子为材料,通过RT-PCR克隆了包含PRDM1基因编码区的cDNA序列。将克隆获得的青海高原牦牛PRDM1基因的cDNA与黄牛相应序列进行比对,对青海高原牦牛PRDM1蛋白与其他物种PRDM1蛋白进行序列比对和进化树分析,对青海高原牦牛PRDM1蛋白的特性和结构进行预测。荧光定量检测青海高原牦牛淋巴结,90日龄胎儿头部皮肤,牦牛精子以及西门塔尔牛精子中PRDM1基因mRNA表达量。结果显示,克隆获得青海高原牦牛PRDM1基因该部分cDNA片段长度为761bp,其中PRDM1基因编码区长741bp,编码246个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛cDNA序列与黄牛该序列存在3个碱基的变异;青海高原牦牛PRDM1蛋白与黄牛、野牦牛、绵羊、马相应序列同源性分别是99.0%,99.0%,97.0%,92.0%;各物种PRDM1蛋白进化树符合物种进化规律。包含卷曲螺旋等典型结构域,人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白1具有94%的相似性,人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白10具有36%的相似性,具有SET结构域活性。青海高原牦牛PRDM1基因在西门塔尔、牦牛精子中表达量极显著高于青海高原牦牛淋巴结(P<0.05),90日龄胎儿头部皮肤中表达量极显著低于青海高原牦牛淋巴结(P<0.01)。从青海高原牦牛克隆获得PRDM1基因编码区揭示了其分子特征,为青海高原牦牛PRDM1蛋白质功能的研究奠定基础。     

类乌齐牦牛UCP3基因克隆与序列分析

利用RT-PCR方法成功克隆UCP3基因,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物学在线分析。结果表明,类乌齐牦牛UCP3基因CDS区序列长为936bp,A、G、C和T平均含量分别为20.83%、28.63%、31.09%和19.44%;与普通牛UCP3基因CDS区序列一致性高达99%;共发现碱基突变位点6个,其中同义突变4个,反义突变2个。UCP3基因共编码311个氨基酸,分子质量为34.18ku,理论等电位点9.53;其主要分布在线粒体内膜上,为非分泌蛋白;具有α-螺旋、无规则卷曲、延伸链、β-转角等结构。由系统进化树可知,类乌齐牦牛与野牦牛最接近,与普通牛次之。     

美仁牦牛MYL9基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆美仁牦牛肌球蛋白轻链9(myosin light chain 9,MYL9)基因CDS区并对其进行生物信息学分析,检测MYL9基因的组织表达特征,为探究该基因功能提供一定理论依据。【方法】以美仁牦牛肌肉组织cDNA为模板,利用PCR扩增并克隆美仁牦牛CDS区序列,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建;通过在线软件对MYL9蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测MYL9基因在美仁牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪和睾丸组织中表达情况。【结果】美仁牦牛MYL9基因CDS区长516 bp,共编码171个氨基酸。系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛、普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远。MYL9蛋白分子式为C₈₅₈H₁₃₂₄N₂₃₄O₂₇₄S₁₂,原子数为2 702,理论等电点为4.85,不稳定系数和总平均亲水性分别为37.22和―0.772,属于稳定亲水性蛋白。MYL9蛋白无信号肽和跨膜螺旋结构,属于非分泌性蛋白;主要定位于线粒体、细胞核、...     

牦牛PRDM9基因的CDS序列及其生物信息学分析

文章通过RT-PCR技术克隆了牦牛PRDM9基因的cDNA序列,利用DNAMAN、MAGA4、ExPASy等多个生物信息学软件进行了分析研究。结果表明:扩增出的牦牛PRDM9基因的编码区长1 533 bp,编码510个氨基酸。与普通牛、人和鼠相应基因核苷酸序列进行比对,其一致性分别为99%、76%和69%。预测的牦牛PRDM9蛋白二级和三级结构显示它是一个具有3种功能结构域的弱碱性螺旋状蛋白。这为今后的进一步研究提供了理论基础。     

犬瘟热病毒N基因克隆及生物信息学分析

犬瘟热病毒(CDV)基因组编码6个结构蛋白,其中N基因编码的N蛋白已被证明存在较多的抗原表位,能够诱导机体产生中和抗体.本研究通过临床病料分离CDV,并对该病毒的N基因进行克隆测序后进行相关生物信息学分析,为今后N基因抗原多表位疫苗的研究提供前期基础.     

牦牛miR-652靶基因预测及生物信息学分析

为进一步探索牦牛miR-652在骨骼肌发育过程中潜在的作用机制,试验从miRbase数据库中下载已有物种的miR-652序列,与牦牛miR-652序列进行比对分析保守性,利用Targetscan软件预测miR-652的靶基因,并与已报道的靶基因合并为靶基因集合;采用g:Profiler和KOBAS 3.0在线软件分别对...     

牦牛BMP2基因生物信息学与表达调控分析

旨在对牦牛BMP2基因编码区序列进行生物信息学分析和编码蛋白功能特征预测,探索其对毛囊发育调控机制.利用ProtParam、ProtScale、SwissModel等在线软件探索BMP2基因编码蛋白的性质与功能,利用MEGA 5.1软件对牦牛和其他物种的BMP2基因序列进行分析并构建系统发育树.结果表明,牦牛BMP2基...     

牦牛miR-381的靶基因预测及生物信息学分析

旨在对牦牛miR-381的靶基因进行预测和生物信息学分析,探索其影响牦牛肌肉发育的作用机制。将高通量测序获得的牦牛miR-381序列与miRbase数据库中已有物种miR-381成熟序列的保守性进行比对分析,利用TargetScan、miRDB和miRanda对miR-381靶基因进行预测,交集的基因与miRTarbase数据库中已证实的靶基因合并后进行基因本体论富集和信号通路富集分析。结果显示,miR-381序列在各物种间高度保守,其靶基因主要参与转录调控过程、横纹肌发育的负调节、细胞周期、心脏发育、肌肉收缩和细胞增殖等生物学过程。信号通路分析结果显示靶基因显著富集于Wnt、TGF-β、MAPK和Notch信号通路等与肌肉发育相关的通路中。由此推测,miR-381可能通过抑制Wnt、MAPK和TGF-β等信号通路的靶基因,进而调控牦牛骨骼肌的发育。研究结果将为进一步探讨miR-381在牦牛肌肉发育中的作用奠定理论基础,同时也为解析牦牛肌肉发育的分子机制提供新的思路。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase,PFKL）基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2 349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C₃₆₇₄H₅₈₉₇N₁₀₅₁O₁₁₀₉S₄₀。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。     

牦牛miR-101的靶基因预测及生物信息学分析

本研究利用相关生物信息学软件和数据库对牦牛miR-101进行了靶基因预测与生物信息学分析。通过高通量测序获取牦牛miR-101的序列,并分析其序列保守性;选取TargetScan、miRanda、PicTar预测结果的交集并结合miRTarbase中已证实的靶基因集合,取二者并集,采用BINGO和DAVID数据库获得靶基因集合的本体注释,进行GO功能富集及Pathway信号通路富集分析。结果显示,miR-101序列在各物种间高度保守,miR-101调控的靶基因GO功能富集主要包括多细胞生物体发育、发育过程、系统发育、解剖结构发育、器官发育等基本生物学过程和蛋白连接、转录因子活性等分子功能;靶基因存在于细胞各个组分中,包括细胞质、细胞核、细胞器中;信号转导通路显著富集于MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、黏着斑（focal adhesion）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）、TGF-beta信号通路（TGF-beta signaling pathway）和mTOR信号通路（mTOR signaling pathway）中（P<0.05）。通过对牦牛miR-101靶基因的生物信息学分析,为进一步研究miR-101在牦牛肌肉发育中的作用奠定基础。     

茶花鸡2号IFN-α基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆茶花鸡2号α干扰素基因（IFN-α）CDS区序列并进行生物信息学分析,为后续研究IFN-α基因对茶花鸡2号免疫功能的影响提供参考。以茶花鸡2号为实验对象设计IFN-α引物,提取总RNA,反转录PCR扩增并克隆其编码区序列,进行生物信息学分析。结果显示茶花鸡2号IFN-α基因CDS序列全长582 bp,IFN-α蛋白等电点5.05,平均疏水指数-0.514,为酸性亲水蛋白,且存在信号肽和1个跨膜区,主要定位于细胞核。IFN-α蛋白被4个N糖基化位点、5个O糖基化位点和20个磷酸化位点修饰,主要由α-螺旋与无规卷曲构成。茶花鸡2号与固始鸡、海兰鸡、惠阳胡须鸡、罗曼鸡和乌骨鸡的氨基酸同源性分别为95.9%、97.9%、97.9%、97.9%和95.9%。IFN-α蛋白与IRF7、IFNAR1、IFNAR2和IFNK等蛋白存在互作关系。本研究结果可为进一步探讨IFN-α基因在茶花鸡2号病毒疾病防治中的作用提供理论依据。     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。