广西香稻Badh2基因两种功能标记的开发

水稻的香味是一种重要的食味品质性状,是水稻第8号染色体Badh2基因突变导致其功能缺失,引起芳香活性物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的积累从而产生香味。Badh2基因至少存在18个等位突变位点,利用等位突变位点辅助培育香稻被证明是一个有效手段。传统Sanger测序法和SSR分子标记PCR电泳分析进行位点检测效率较低。为了开发效率更高的检测方法,本研究利用了实时荧光PCR检测技术对广西地方常见的水稻突变荧光分子标记。对40份广西地方香稻的Badh2基因进行直接测序,发现这些香稻的Badh2基因主要存在两种突变,第4、5外显子806 bp缺失(badh2-E4-5.1)和第7外显子8 bp缺失(badh2-E7)。针对这两种突变类型设计实时荧光PCR检测方法,并对已测序的40份香稻进行验证,实时荧光PCR检测的准确性达到93.75%。进一步对50份地方品种进行香味基因型分型鉴定,其中24份香稻为badh2-E4-5,22份香稻为badh2-E7。本研究针对广西地方香稻品种的主要两种突变类型,设计开发了这两种等位基因的荧光分子标记,适用于香稻基因型的鉴定筛选,对香稻育种具有重要的现实意义。     

香稻种质资源筛选及香味基因遗传研究

本试验采用KOH浸泡法和香味功能标记对144份水稻品种进行香稻种质资源的筛选,同时以2个杂交组合平粳11/黑香稻、吉林日落/黑香稻的F:群体为试验材料,对黑香稻香味基因进行遗传分析。结果表明,用KOH浸泡法筛选时,有20个水稻品种产生香味;用香味基因功能标记GRFM04筛选时,仅有17个含有香味基因。黑香稻,SY-香-7、清香糯用KOH法筛选产生香味,但用功能标记GRFM04检测为不含有香味基因。黑香稻的香味受1对隐性基因控制,在纯合基因型中水稻叶片的香味与米粒的香味呈高度一致性,但在杂合的基因型中,叶片无香的单株,其米粒有无香与有香的分离。     

不同香味等位基因粳稻的分子和香味特性研究

利用水稻甜菜碱醛脱氢酶Badh2基因的两个外显子缺失标记引物从60份优质常规粳稻中筛选到11份香稻材料,对其分子基础和香味特性进行分析。追踪香稻系谱,发现外显子7缺失的材料其香味可能与籼稻种质有关。进一步利用第8染色体上37对SSR引物分析11份材料遗传基础,结果有20对呈现多态且检测到64个等位基因变异,平均等位基因数目为3.2个。聚类分析发现苏香粳1号和苏香粳2号归为一类且与其他材料遗传距离较远;对两品种感官评价发现幼苗植株和米饭香味特性均表现突出。利用半定量RT-PCR检测幼苗植株香味基因的表达量,发现不同品种幼苗地上部表达各异,且根部有香味基因不同程度的表达。研究结果为了解粳稻品种的香味特性和香稻育种提供了一定依据。     

水稻种质资源香味基因Badh2的分子鉴定及香稻筛选

稻米香味性状是稻米品质的重要评价指标,香稻的培育是提高稻米附加值进而提高农民种粮积极性的有效手段,而香稻育种面临遗传背景来源单一的瓶颈大大制约了香稻的育种进程。发掘和利用香稻种质资源,扩大香稻遗传多样性是解决这一问题的主要途径。本研究利用已知水稻香味基因Badh2的分子标记,分析了来自世界各地的817份水稻种质资源及25份野生稻祖先的Badh2基因型。通过品尝法对具有突变型Badh2的稻米进行了香味性状鉴定,研究结果表明,83份水稻种质资源材料具有突变型Badh2基因,其中包括籼稻52份、粳稻30份、中间型1份;而普通野生稻和尼瓦拉野生稻均为野生型Badh2,表明香味性状是在栽培稻驯化过程中由香味基因Badh2自然突变产生。通过人工咀嚼法对83份具有突变型Badh2的稻米进行了香味性状鉴定,结果表明有28份稻米具有明显的香味,其中籼稻为20份,粳稻7份,中间型1份,并且籼稻香味浓郁程度普遍高于粳稻,推测Badh2受遗传背景影响而导致2-乙酰-1-吡咯啉在籽粒中积累量不同。本研究鉴定的香稻种质资源将为开展稻米香味性状遗传改良提供重要材料支撑。     

花香A香味基因的鉴定和表达分析

选择和培育综合性状优良、配合力好的香稻亲本,对提高杂交水稻香稻育种至关重要。花香A是四川省农业科学院生物技术核技术研究所通过航天育种技术培育而成的优良香稻不育系,其配制的组合米质优、香味浓。为了探究花香A香味产生的原因,本研究鉴定了花香A香味基因的类型,研究了遗传规律和表达模式等,发现其香味基因类型为Badh2-E7,香味基因Badh2在花香A中表达量较低,在花香A/川恢907的F2代不同纯合单株中表达水平存在明显差异;实验还证明了标记FMbadh2-E7可高效鉴别出不同基因型。本研究为通过分子标记辅助育种技术,应用花香A香味基因培育优质杂交香稻奠定了坚实的基础。花香A在杂交水稻育种中展现出更广阔的应用前景。     

‘泰国小香占’香味基因的鉴定和功能分子标记的开发

香稻育种已成为当前杂交水稻育种的一个重要方向,选择和利用株型好、米质优、抗性强等综合性状优良且具有香味的水稻亲本,尤其是香型水稻恢复系亲本的利用,对进一步促进杂交水稻香稻的选育具有重要意义。‘泰国小香占’是目前国内水稻香稻育种中应用较广且综合性状优良的恢复系亲本,其米质优、抗性强、香味浓。为了探究‘泰国小香占’香味产生的原因,本研究鉴定了‘泰国小香占’的香味基因及其突变类型,发现其香味来源于编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2的功能缺失突变,且通过对该基因完整基因组序列扩增和测序分析发现其等位突变类型为badh2-E7类型,即在第7外显子处存在8 bp缺失和3个单核苷酸位点多态性突变(SNPs)。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定其籽粒中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量为0.108 mg/kg,明显高于非香味品种‘日本晴’和‘9311’的含量(0.01 mg/kg)。实验还证明了特异性分子标记FMbadh2-E7、InDel-E7以及自主开发设计的特异性功能标记FMbadh2-E7A和FMbadh2-E7B均可高效、准确鉴别出非香纯合(Badh2/Badh2)、非香杂合(Badh2/badh2)和香味纯合(badh2/badh2) 3种基因型。同时本研究还进一步通过对‘泰国小香占’和非香味水稻品种杂交F2代单株进行了基因型和遗传规律分析,发现其基因型Badh2/Badh2:Badh2/badh2:badh2/badh2的比例为1∶2∶1,符合孟德尔细胞核单基因控制分离比。本研究通过对‘泰国小香占’香味基因的鉴定、遗传特性分析以及特异性功能分子标记的开发和验证,为进一步通过分子标记辅助选择育种技术,应用‘泰国小香占’香味基因培育优质、高产且抗性强的杂交水稻香稻提供了重要的理论基础。     

新型香稻渝恢2103香味分子遗传特性分析

香味是优良稻米品质的重要衡量标准之一,2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)是最主要的香味物质,然而2AP生物合成机理至今仍未确凿。本研究筛选了与2AP生物合成密切相关的甜菜碱脱氢酶2基因(Badh2)在30份水稻材料中的3种突变类型,从中发现1份新的香稻材料渝恢2103,该材料Badh2基因序列编码区无突变,遗传分析显示渝恢2103与badh2-E7突变型香稻宜香1B香味基因不等位,与非香稻杂交F2香与非香分离比接近9∶7,与香稻杂交F2香与非香分离比接近7∶9,表明渝恢2103的香味受多基因控制。进一步利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)比较了与2AP生物合成相关基因在日本晴、渝恢2103和宜香1B的表达情况,结果显示,Badh2基因在日本晴和渝恢2103中表达差异不大,但在宜香1B中表达量异常高;多数脯氨酸与谷氨酸代谢途径相关基因在宜香1B中的表达水平显著高于日本晴和渝恢2103;推测宜香1B的2AP合成同时受Badh2基因以及脯氨酸与谷氨酸代谢途径相关基因的影响;渝恢2103香味形成可能与这些基因无必然联系。渝恢2103特殊的遗传特性可能为水稻香味形成机理研究提供新的突破点。     

利用分子标记辅助选育优质香稻新品种‘桂香99’

本研究以优质抗稻瘟病香稻品种‘巴太香占’为母本,高产优质抗稻瘟病品种‘象牙香占’为父本,通过传统田间选育杂交技术与分子标记辅助选择结合,分别利用香味等位基因Badh2-E7的功能标记和广谱抗稻瘟病基因Pi5、Pita、Pi2的功能标记对各分离世代优选的单株材料进行标记检测,并结合香味检测,育成含Pi5、Pita、Pi2的优质香稻新品种‘桂香99’,以满足市场的迫切需求。     

基于功能性分子标记鉴定香味杂交粳稻亲本

香稻是由于水稻种水稻甜菜碱醛脱氢酶(BADH2)基因的功能缺失突变引起的。根据香味等位基因badh2的功能性突变位点设计的功能性分子标记,为快速鉴定具有香味的水稻种质资源提供了可能。本研究利用香味等位基因badh2-E2和badh2-E7的功能性分子标记InDel-E2和InDel-E7鉴定了33个杂交粳稻不育系和35个杂交粳稻恢复系材料的基因型,获得了12个含有badh2-E2等位基因不育系和4个含有badh2-E7等位基因恢复系材料。在此基础上,分别选择了3个不育系和3个恢复系,配制了5个全香型的杂交粳稻,为香味杂交粳稻的推广应用提供了理论依据。     

两种筛选水稻badh2-E2类型香味基因分子标记的建立

本研究根据香味基因(badh2-E2)与非香基因(Badh2)在第2外显子7个脱氧核苷酸序列缺失差异,建立了一个新的STS分子标记和检测方法;并根据badh2-E2与Badh2+310 bp位点脱氧核苷酸的差异性,建立一个新的CAPS(EheⅠ)分子标记和检测方法。结果显示:建立的STS分子标记与前人的报道相比扩增的条带更小,只有100 bp左右,能够更加清晰地鉴别出香与非香基因型之间的差异;而建立的CAPS(EheⅠ)分子标记,纯合非香稻可获得长度为292 bp和375 bp两条带,纯合香稻可获得长度为667 bp一条带,杂合F1植株可获得长度为292 bp、375 bp和667 bp3条带,对于不同基因型检测结果的判断效果更明显。采用本研究建立的方法能够提高水稻badh2-E2类型香味基因选择效率。     

云南粳稻主栽品种的香味基因鉴定和不同检测方法的比较分析

本研究利用四引物等位基因扩增受阻突变体系PCR技术,结合KOH和咀嚼判定法,分析了86份云南粳稻主栽品种和2份对照粳稻品种的香味特性和香味基因的存在情况和基因型。研究结果表明:三种方法共检测到10个品种具有香味或携带香味基因(badh2),但三种方法的鉴定结果存在差异性。其中5个品种三种方法均能检测到香味并携带香味基因(badh2),2个品种用KOH法检测到香味但不携带香味基因(badh2),1个品种用KOH法检测到香味且携带香味基因(badh2),1个品种用咀嚼法检测到香味并携带香味基因(badh2),1个品种用KOH法和咀嚼法都未检测到香味但携带有香味基因(badh2)。PCR扩增DNA检测结果分析所有材料共出现3种香味基因型,即非香型Badh2/Badh2、杂合型Badh2/badh2和香型badh2/badh2。香味基因(badh2)在所分析云南粳稻主栽品种中出现的频率仅为8.1%,香味性状受badh2等位基因控制,且都为云粳系列的品种。研究发现将四引物等位基因扩增受阻突变体系PCR技术和咀嚼法相结合,可以提高香味性状的选择效率和准确性。     

豫南稻区特种稻香味和有色果皮基因鉴定

为明确豫南稻区特种稻香味和有色果皮基因型,进一步促进豫南特种稻的遗传改良及新品种选育。本研究选用53份特种稻种质资源,针对水稻第8号染色体上香味基因Badh2的第2外显子和第7外显子设计相应分子标记,结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序技术,分析特种稻资源中香味基因变异情况。结果显示,53份材料中有18份材料Badh2基因第2外显子上出现7 bp碱基缺失,其中‘银香1号’为杂合基因型;19份材料Badh2基因第7外显子上发生8 bp缺失和3个单核苷酸位点多态性变异,其中‘黑香糯160’、‘鄂香1号’和‘美香占2号’属于杂合基因型。同时,对有色特种稻黑色果皮基因Ra和红色果皮基因Rc进行分析,结果表明,11份黑色稻米均在Ra基因第7外显子处缺失碱基“GT”;普通白米与2份红色稻米相比在Rc基因第6外显子处存在14 bp碱基缺失。本研究利用分子标记技术对豫南特种稻香味和有色果皮基因进行了分析,为豫南特种稻种质资源筛选评价和分子设计育种选育或创制聚合多种优良性状的特种稻新品种提供了理论依据与技术支持。     

不同来源水稻种质资源香味基因badh2位点的鉴定

发掘和利用香稻基因资源是开展优质香稻品质改良的首要条件。本研究利用水稻香味功能基因分子标记,结合传统的味觉和嗅觉鉴定法,分析了不同来源不同类型的323份水稻种质的香味性状。研究结果表明:利用分子标记技术和谷粒咀嚼品尝是快速、准确鉴定水稻香味性状的优选策略;香味基因badh2位点频率在印度尼西亚和泰国的籼稻中达到68.2%以上,在美国、俄罗斯和意大利的粳稻中较低,在云南、缅甸、老挝和尼泊尔的普通野生稻中没发现;在发现的具香味性状的86份种质中,极大部分种质的香味性状受badh2等位基因控制,但有6份的香味性状可能不受badh2等位基因控制。这些香稻基因资源将是下一步开展稻米香味遗传分析以及香米品种改良的重要基础。     

基于PCR/LDR技术的水稻香味等位基因Badh2-E2功能性分子标记

水稻中水稻甜菜碱醛脱氢酶(BADH2)功能缺失导致其酶促反应的底物2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的累积,使得稻米产生香味。水稻香味等位基因badh2-E2在中国的香稻育种中有较广泛的应用。本研究根据badh2-E2香味等位基因在第二外显子处7 bp缺失,设计了一个基于PCR/LDR技术的功能性分子标记。利用PCR/LDR标记对‘申繁24’、‘申恢26’,及其杂交F_1代的基因型进行鉴定,可以准确地鉴定出badh2-E2位点的基因型。用PCR/LDR标记对杂交F_2代群体的基因型进行鉴定,发现badh2-E2阳性纯合型、杂合型和badh2-E2阴性纯合型这3种基因型符合1∶2∶1分离比。本研究结果为标记辅助育种提供了一种新的标记类型,具有一定的应用价值。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因改良粳稻香味

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。     

利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。     

香型优质杂交稻‘渝香203’香味基因遗传分析

香味是水稻重要的品质性状之一。‘渝香203’是不育系‘宜香1A’与恢复系‘R2103’杂交而成的香型优质品种,具有香味浓、米质优、适口性好等特点。本研究通过‘渝香203’及其亲本香味的遗传分析发现,该品种的香味由2对不等位的隐性基因控制,且其商品粮的稻米香味比例高于普通香型杂交稻;Badh2基因的功能标记鉴定及该基因测序分析显示,‘宜香1A’的香味由其Badh2基因第7外显子的碱基变异引起的,而‘R2103’的香味不是Badh2基因控制的。因此‘R2103’是一个新香型种质资源,对其深入研究可为完善水稻香味遗传机制、高品质新材料创建与品种选育提供参考。     

基于CRISPR/Cas9技术创制宜直播香型水稻

水稻香味可显著改善稻米品质,香稻相较于普通稻米更易获得消费者青睐。为快速创制宜直播香型水稻新种质,探索提高豫南地区籼稻稻米品质新途径。本研究以宜直播籼稻品系‘直优151’和粳稻模式品种‘日本晴’为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻香味基因Badh2第2和7外显子处分别设计靶序列,构建pC1300-Cas9-E2单敲除表达载体和pC1300-Cas9-E2-E7双敲除表达载体,并分别转化‘直优151’和‘日本晴’。经筛选鉴定共获得21株‘直优151’突变株系和32株‘日本晴’突变株系,包括纯合突变、双等位突变和杂合突变类型。与野生型相比,突变体株系的株高、有效穗数、每穗总粒数、结实率和千粒重均未发生显著变化。使用气相色谱质谱法测定突变株系稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量,结果表明,与野生型相比各突变株系2-AP含量均极显著提高。本研究基于CRISPR/Cas9技术成功对水稻香味基因Badh2进行靶向编辑,快速创制了宜直播种植的香型‘直优151’突变株系,为豫南稻区直播籼稻提供了优质香型新种质。     

等位基因特异扩增在水稻香味遗传改良中的应用价值

常规育种方法培育香型水稻除了育种年限长,且在后代材料选择过程中,香味基因往往容易丢失。而通过回交转育手段将香味性状导入优良的非香型水稻品种中,则要寻找出一种高效的分子检测手段加以辅助鉴定。本研究以稻花香2号、金禾香稻、南韩长粒香、黑香米,以及8个非香稻品种(品系)为试验材料,利用等位基因特异扩增方法对水稻香味基因进行鉴定。结果表明,南韩长粒香、黑香米及非香稻获得长度为585bp和355bp的两条带,而稻花香2号、金禾香稻仅获得长度为577bp的一条带,供试材料的分子检测结果与香味基因型不完全一致,这在一定程度上限制了等位基因特异扩增法在水稻香味遗传改良中的应用。     

27种香稻品种badh2突变位点序列的分析

水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因(Badh2)第7外显子和第2外显子的突变是导致稻米变香的主要原因。本研究分别对包含第7外显子或第2外显子的PCR产物进行测序分析,以明确27种适宜海南省种植的香稻品种的Badh2的突变序列。研究结果表明:海香5701、山栏香糯、海香6309等20个品种Badh2基因的突变类型为第7外显子发生了8 bp的缺失和3个碱基的突变,所有27个水稻香稻品种第2外显子序列都未发生改变。本研究结果可为这些香稻品种的保护与鉴定、及作为香味基因供体改良其他优良品种奠定基础。