多重PCR结合变性高效液相色谱技术转基因小麦检测方法的建立

为了满足对小麦转基因成分高通量快速检测的需要,建立了一种新的转基因小麦检测方法。通过对不同稀释倍数的转基因小麦品系B7361中的内源基因Wx012、外源基因ubiquitin、bar、nos、uidA进行单一PCR和多重PCR扩增,应用琼脂糖凝胶和变性高效液相色谱（DHPLC,denaturing high performance liquid chromatography）技术分离PCR 产物,进行灵敏度分析,并用非转基因小麦京花1号籽粒、大豆籽粒、麦片、转基因小麦B7361加工成的油炸制品为样本,对建立的检测体系进行检测。结果表明,样品经多重PCR扩增和DHPLC分离后,能够得到准确可靠的转基因图谱。与凝胶电泳方法比较,本研究所建立的多重PCRDHPLC具有更高的检测通量和灵敏度(能够同时检测5个基因,灵敏度达到1 ng·μL^-1),能够满足小麦转基因成分的高通量快速检测的要求,同时也为转基因产品检测提供了一种新的技术手段。     

应用多重PCR-DHPLC方法快速检测转基因马铃薯及EH92-527-1品系鉴定

以EH92-527-1转基因马铃薯为试材,应用多重PCR技术同时扩增马铃薯的内源基因(UGPase)和外源基因(NOS终止子、NPTII结构基因和EH92-527-1品系特异基因),将扩增产物在DHPLC非变性条件下分离,分析几个基因扩增的结果;将模板进行稀释,确定了方法的检测灵敏度,并与凝胶电泳结果相比较,建立了马铃薯转基因成分筛选检测及品系鉴定的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)方法。试验结果表明,该方法能够同时筛选检测转基因马铃薯的四个内、外源基因,且与凝胶成像相比,有更好的检测灵敏度,可达到1 ng/μL。本文首次建立的马铃薯多重PCR-DHPLC检测方法,能够高通量快速准确的检测马铃薯中的转基因成分及对品系进行鉴定。     

应用MPCR-DHPLC技术检测转基因大豆及其食品

利用多重PCR结合DHPLC技术,建立了高通量快速筛选检测转基因大豆及其食品的方法,确立了转基因大豆品系鉴定方法.该筛选方法的检测灵敏度为0.078 ng· μL-1,质粒检测灵敏度为1 × 103拷贝·μL-1.利用该方法对转基因大豆GT-40-3-2、Mon89788、A5704-12和大豆食品曲奇饼干、含大豆的调味粉、干豆腐及非转基因黑大豆进行验证,效果良好.所建立的PCR-DHPLC检测方法能同时快速准确的检测大豆及加工食品中转基因成分.     

抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 RPA快速检测方法的建立

瑞丰125为农业农村部首批获得生产应用农业转基因生物安全证书的抗虫耐除草剂转基因玉米之一。为给监管转基因生物安全提供支撑，利用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术，针对瑞丰125的转化体插入位点序列设计了引物并进行筛选，对反应的温度、时间和引物浓度进行了优化。结果显示，RPA体系在30～45℃范围内，20 min即可有效扩增，比PCR检测时间大大缩短。引物浓度会影响RPA的扩增效率，引物终浓度为0.35μmol/L时扩增效果最好。同时对RPA检测方法的特异性、灵敏度等进行考察，结果表明该检测方法的特异性良好，检测灵敏度可达到36拷贝。该恒温快速的检测方法为瑞丰125的快速检测提供依据，为商业化转基因作物的监管提供支撑，有望用于转基因成分的现场快速检测。     

种子DNA快速提取法在玉米转基因检测中的应用

利用一种快速玉米基因组DNA提取方法,分别对Bt11、MON810、NK603、MIR604和TC1507这5种转基因玉米种子的胚和胚乳进行DNA提取。根据不同转基因玉米重组结构点,分别设计特异性引物,参考农业部转基因检测标准,通过对PCR体系的优化整合后发现,该玉米DNA快速提起法获得的PCR检测结果准确、可靠,在此基础之上建立一套多重PCR,使转基因检测的效率得到很大提高。     

多重PCR技术检测4种大豆镰孢菌根腐病病原

镰孢菌是引起大豆根腐病的常见病原菌,传统检测病原镰孢菌的方法存在操作繁琐、时间长、成本高和 效率低等缺点,建立一种快速检测方法显得尤为重要。本研究基于翻译延伸因子序列（EF-1α）建立了检测镰孢菌 （Fusarium species）的多重PCR反应体系,检测了多重PCR体系灵敏度,模拟侵染样本验证多重PCR技术的可行性。 实验结果表明,该方法能够通过扩增片段的大小区分锐顶镰孢菌（Fusarium acuminatum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰孢菌（Fusarium solani）和禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）。灵敏度检测显示,最低检测基因 组DNA浓度达1×10-4 ng/μL;模拟侵染样本实验表明,使用镰孢菌和大豆基因组混合样本作为模板,在DNA浓度为 100 ng/μL时仍能准确检测出目的条带。因此。以翻译延伸因子序列为靶标建立的多重PCR技术,能够灵敏、特异 性地检测出该四种镰孢菌,可在复合侵染引起大豆镰孢菌根腐病的病原菌鉴定中准确检测。     

应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034

根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。     

环状等温扩增技术快速检测转基因玉米MON863的研究

采用环状等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对转基因玉米品系MON863中玉米基因组与外源基因结合处设计4条特异性引物,建立MON863的快速检测技术体系,并对时间、温度等反应条件及体系灵敏度、特异性等进行探索。结果表明:该检测体系最适反应温度为63℃,反应时间60 min,灵敏度是常规定性PCR的10倍。该检测方法具有高度的特异性和稳定性,操作方便、简单、省时。     

定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究

转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息,在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物,检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明,该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度,结果表明,检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证,进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件,检测方法的灵敏度可达0.1%,且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。     

利用多重PCR技术快速检测五个转基因大豆品系

转基因大豆305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043作为商品化应用最为广泛的大豆品系,种植面积占世界转基因大豆总种植面积的80%以上。根据大豆内标准基因Lectin和5种转基因大豆品系的边界序列设计特异性引物。通过验证引物的适用性、特异性和灵敏度,优化多重PCR检测体系中不同引物的用量及反应退火温度,建立了能同时扩增大豆内源基因Lectin和5个转基因大豆品系的六重PCR检测体系。结果表明:确定的大豆内源基因和5个转基因大豆品系的引物具有很好的特异性,引物之间无交叉扩增和非特异性扩增,多重PCR方法的检测灵敏度达到0.1%。该方法可作为转基因大豆及其产品成分检测的辅助手段,快速检测转基因大豆及其产品中的相应品系。     

The comparison of the effectiveness of a modified conformation sensitive gel electrophoresis with denaturing high performance liquid chromatography

Background: Several methods have been developed for detection of sequence variation in genes and each has its advantages and disadvantages. A disadvantage of them is that the simpler, cost-effective methods are commonly perceived as being less sensitive in their detection of sequence variation, whereas those with proven sensitivity have a requirement for complex or expensive laboratory equipment. In this context, we undertook improvements to the conformation sensitive gel electrophoresis (CSGE) method which provides a cost-effective approach to mutation detection and compared the results with scanning carried out using denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) which utilises a dedicated analyser. Methods: We designed PCR primers to amplify the seven protein-coding exons of the human SPP2 gene which encodes secreted phosphoprotein 24 (spp24) such that the amplified products included the immediately-adjacent intronic regions. Five improvements were made to the CSGE method that was used to the scan the PCR-amplified DNA. The scanning was then repeated using DHPLC and the results were compared. Results: Using CSGE, a single nucleotide polymorphism was discovered in exon 2 and another in intron 2 of the gene. Re-scanning of the same regions by DHPLC detected no additional sequence polymorphisms. Conclusion: With modification of the original protocol, CSGE is capable of providing a simple and cost-effective approach to the detection of DNA sequence polymorphisms that appears to be comparable in sensitivity to DHPLC.     

应用多重荧光PCR快速筛查作物中转基因成分研究

通过对我国批准进口的和获得农业转基因生物安全证书的转基因玉米转化体的序列分析发现,除DAS40278-9和BLVA430101外,CaMV35s启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因和pat基因覆盖了21种玉米转基因转化体。通过引物组合筛选、反应体系优化、灵敏度测试、适用性测试等实验,建立了基于4个通用筛选元件及zSSIIb内源基因的五重荧光PCR和基于转化体特异性序列的二重荧光PCR检测转基因成分方法体系。方法参数测定结果表明,此方法特异性强、稳定性好,检测灵敏度达到0.05%。同时,此方法体系不仅适用于转基因玉米成分筛查,对大豆、水稻等多种作物进行转基因成分筛选鉴定也有良好的适用性。     

大豆和玉米加工产品中外源转基因成分检测技术的建立

采用PCR技术检测CaMV 35S启动子,并进一步通过PCR检测RoundUp Ready Soybean(RRS)和Btl76 Maximaizer的特异性DNA片段,判断大豆和玉米加工产品中是否含相应转基因成分.在1份豆粕和豆腐样品中检测到了RoundUp Ready大豆特异性的498 bp片段,而在玉米粒样品中检测到了Btl76特异性转基因成分.PCR检测的灵敏度达到0.1%,稳定性良好.结果表明,PCR技术检测外源基因是灵敏和准确的,可以广泛地应用到转基因作物及其加工产品的转基因成分检测中.     

HSA转基因水稻二重微滴数字PCR定量检测方法研究

重组人血清白蛋白（HSA, Human serum albumin）基因工程水稻是我国自主研发的可规模化生产水稻重组人血清白蛋白（OsrHSA）的转基因品系，具有极高的推广价值和应用前景，但是目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。微滴数字PCR（ddPCR, droplet digital PCR）是近年来新兴的前沿PCR技术，不依赖标准物质即可实现对DNA分子的绝对定量，在转基因产品定量领域被广泛应用。本研究基于ddPCR平台建立了适用于重组人血清白蛋白基因工程水稻（114-7-2品系）的二重ddPCR精准定量检测方法。通过对引物探针的特异性进行验证、对引物探针工作浓度和反应退火温度进行优化，获得最佳反应条件。进而对该方法检测限、定量限和结果重复性做了测定。最后通过对不同含量的重组人血清白蛋白转基因水稻样品进行定量检测，分析比较传统实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和二重ddPCR的优劣，结果表明本研究建立的转基因水稻HSA/PLD二重ddPCR方法稳定性更好、灵敏度高、成本低廉，精准可靠，适用于不依赖标准物质的精准定量HSA转基因水稻转化体含量分析，可取代qRT-PCR方法进行HSA转基因水稻的绝对定量检测，完善了我国转基因水稻成分精确定量检测技术体系。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测利玛原甲藻的研究

建立应用SYBR Green实时荧光定量PCR技术快速定量检测利玛原甲藻的方法。结果表明,理论上,该方法对于4个利玛原甲藻细胞便可检测出,灵敏度较高;实际应用时检测出的细胞数为(505±14.72)cells/L(镜检为600 cells/L,误差为15.83%,符合海洋调查规范中浮游生物调查误差在20%以内的要求)。本检测方法具有快速、特异、准确等优点,可作为海洋环境监测中定性定量检测利玛原甲藻的方法。     

转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法的建立

为了防止国外商业化生产的转基因番木瓜流入国内市场,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法,对于保护国内消费者知情权意义重大。本研究以转基因抗环斑病毒番木瓜 55-1 为研究材料,利用外源基因和番木瓜基因组序列设计了 9 对特异性检测引物,通过特异性引物筛选、熔解曲线分析、退火温度优化、特异性验证、灵敏度分析及检测限验证,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法。结果表明：本研究筛选出的检测引物,可特异的检出转基因番木瓜 55-1 转化事件,引物的检测灵敏度达到了 0.1%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求,完全可满足转基因检测标识制度的顺利实施。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。