利用PCR技术体外扩增牛Y染色体特异DNA序列的研究

本实验建立了用ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术体外扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列的方法。根据牛的ＳＲＹ序列设计一对引物，两条引物均为２３ｂｐ，对公牛１９４ｂｐ序列进行体外扩增。从屠宰的公、母牛肝和血液中提取ＤＮＡ，用作ＰＣＲ模板，ＰＣＲ仪内进行扩增。结果表明公牛个体样品显示清晰可见的特异ＤＮＡ扩增带，而母牛个体样品无扩增片段出现，与预期的结果完全符合。     

高简并引物小温度范围不规则降落PCR在庞大基因家族扩增中的应用（摘要）

[目的]探讨了高简并性引物扩增庞大基因家族基因的特殊方法。[方法]采用常规高简并引物对鲤鱼基因组DNA分析进行了常规PCR扩增、常规降落PCR扩增以及优化后的小温度范围不规则跳跃降落PCR扩增。[结果]采用PCR仅得1条明显条带,得到的基因较少;采用常规降落PCR法仅得到弥散性扩增,无明显条带出现;而采用小温度范围的不规则跳跃降落PCR则得到了得到了3条明显条带和多个基因,扩增结果理想。[结论]为庞大基因家族扩增条件中的优化与选择提供了理论依据。     

常规PCR法扩增口蹄疫病毒基因组5’端序列的探索

【目的】扩增口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)基因组5’端序列,为获得基因组全长准备基础。【方法】将FMDV O/Akesu/58 CE39A株液氮冻存基因组RNA反转录三次,对c DNA的5’端序列进行扩增、克隆、测序。【结果】以c DNA1与c DNA3为模板,用LA Taq DNA polymerase、EX Taq DNA polymerase、Prime STARHS DNA polymerase及3对引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均未扩增出5’端目的片段;以c DNA2为模板,用LA Taq DNA polymerase为扩增酶,两对引物Ⅰ、Ⅱ均能扩增出5’端目的片段,且所测得的序列长度787 bp、797 bp与参考序列核苷酸同源性分别为86.2%和86.3%。【结论】常规PCR法扩增5’端序列较其它技术具有价格便宜、操作简便等优点,但扩增成功率偏低。试验共进行了72次PCR,成功率为6/72,说明FMDV 5’端序列的扩增难度大,应合理设计反转录引物和扩增引物。为许多RNA病毒反向遗传学研究提供了更多的选择。     

用等位基因特异PCR检测普通小麦（Triticum aestivum L.）的单核苷酸多态性

 【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系（RIL）的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料，研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列，在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3?端，设计等位基因特异引物及其互补引物，对SNP进行分型，同时研究了特异引物3?端碱基错配对等位基因特异PCR的影响，优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3?端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大；在等位基因特异PCR中，Mg2+、dNTP及Taq DNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3?端加上合适的错配碱基，并且优化其PCR反应体系，用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。     

大麦黄矮病毒（BYDV—GPV）的循回传播机理

对植物组织中蚜虫口针分泌的胶状唾液染色观察发现，蚜虫刺探时口针穿行在细胞间隙，仅在吸食时下颚口针进入细胞内。禾谷缢蚜饲毒１２ｈ时的ＲＴ－ＰＣＲ方法在后肠，血淋巴液和附唾液腺中检测到ＧＰＶ；而非介体麦长管蚜在ＧＰＶ毒源上吸食２４ｈ时，仅在后肠组织中检测到ＧＰＶ；当继续取食４８ｈ时，在后肠及血淋巴液中也发现了ＰＧＶ，但仍无能力进入附唾液腺，说明蚜虫后肠对病毒均有专化选择作用，禾谷缢管蚜传播ＢＹＤＶ－Ｇ     

巢式PCR（Nested—PCR）在植原体检测中的应用

通过直接PCR(Direct-PCR)和巢式PCR(Nested-PCR)技术,利用植原体16S rDNA通用引物对泡桐丛枝和小麦蓝矮两种植原体病害不同发病时期进行了检测研究,结果表明:夏季采集的泡桐丛枝的叶片和枝干、及接种2周显症小麦均可扩增出1.4kb和L 2kb的特异条带,而冬季采集的泡桐丛枝中未扩增出特异条带;接种1周的小麦通过直接PCR扩增未见特异条带,但对其进行巢式PCR扩增便可获得1.2kb的特异条带.说明巢式PCR在植原体病害的检测中是一种灵敏、准确、快速的方法.     

猪圆环病毒2型SYBR—Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性和重复性较好。【结论】建立了检测PCV2的SYBR-Green 1荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析PCV2感染程度奠定了基础。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较（英文）

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和Taq Man探针,构建分别包含PCV2 ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于PCV2 ORF1和ORF2的Taq Man荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μl,ORF2方法可达1.0×102copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

引起种（蛋）鸭输卵管积液综合征的新发病毒—C型禽偏肺病毒

【目的】明确引起种（蛋）鸭特征性输卵管积液和产蛋下降的新发疫病[俗称种（蛋）鸭输卵管积液综合征]的病原。【方法】对自闽粤赣浙皖桂等地产蛋率较高的部分鸭群表现以输卵管内乳糜性积液、黏膜出血水肿增厚及不同程度产蛋下降为特征的病（死）麻鸭、樱桃谷种鸭和种番鸭中采集的样品（输卵管积液、输卵管黏膜、卵巢和肝脾脏器）,开展鸭已知病原核酸监测、病原分离鉴定和开产麻鸭人工感染试验。【结果】细菌分离显示,输卵管积液里未分离到细菌,排除细菌感染引起;经病毒核酸监测,只有C型禽偏肺病毒（Avain metapneumoviurs subgroup C,aMPV/C）阳性,未检测到其他引起禽产蛋异常的病毒;以aMPV/C单一阳性的样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种鸭胚未见死亡,但胚体表面稍水肿和出血、肝脏出血;对第5代鸭胚液进行RT-PCR检测,结果显示a MPV/C分离阳性率为72.2%;对获得的4株分离株（JX2126、FJ2228、FJ2375和GD2381株）的基因片段进行测序和序列分析发现,该片段与最早报道的番鸭a MPV/C法国分离株（Muscovy duck/1999/99 178/Fran...     

特异性DNA序列的PCR放大技术及其研究进展

本文重点探讨了PCR放大机理、操作技术、系统扩展和应用研究诸方面的有关问题,并介绍了作者提出的“PCR放大产物的转变与积累规律”。     

牛CD18编码全基因特异引物设计与PCR扩增

为了获得牛整合素CDl8亚单位编码全基因序列以进行牛白细胞粘附缺陷病(BLAD)相关研究,采用DNAstar引物设计软件对网上牛CDl8mRNA编码全基因序列及其限制性内切酶酶切位点进行分析,设计一对PCR扩增引物,经PCR扩增条件优化后,获得含有CD18编码全基因序列的2350bpPCR产物。     

杂草稻叶绿体psbA-trnH片段的PCR扩增条件优化

对杂草稻叶绿体psbA-trnH片段的PCR扩增条件进行了优化,建立的最优体系为:20μL反应体积含1μL模板DNA,O.125mM dNTPs.0.5μM 正向引物,1U Taq酶,2.0μL 10 xTaq PCR buffer;退火温度为61℃,在此条件下充分保证了psbA-trnH PCR产物的质量和纯度要求.对该片段进行了直接测序,结果为510bp左右,在NCBI中比较分析表明其测序结果准确可靠.经ClustW分析表明含有丰富的系统学信息.     

镰刀菌基因组DNA的抽提及特异片段的扩增分析

实验运用改良的SDS碱裂解法对30株镰刀菌基因组DNA进行了抽提,并对rDNA ITS区域进行了特异性扩增。结果表明:被测菌株DNA片段大于20 kb,其OD260/OD280大都在1.6~2.0之间,可见用改进的方法抽提的基因组DNA比较完整,纯度较高。实验采用对镰刀菌属有特异性的寡聚核苷酸为引物,对镰刀菌基因组rDNA基因进行扩增,该引物可以扩增出18S、28S部分片段及ITS区域,电泳检测其片段大小在1 041~1 135 bp之间,且特异性良好,为进一步进行RFLP及核苷酸序列分析奠定了基础。     

高简并引物小温度范围不规则降落PCR在庞大基因家族扩增中的应用

[目的]探讨高简并性引物扩增庞大基因家族基因的特殊方法。[方法]采用高简并引物对鲤鱼基因组DNA分别进行了常规PCR扩增、常规降落PCR扩增以及优化后的小温度范围不规则跳跃降落PCR扩增。[结果]采用常规PCR仅得1条明显条带,得到的基因较少;采用常规降落PCR仅得到弥散性扩增,无明显条带出现;而采用小温度范围不规则跳跃降落PCR则得到了3条明显条带和多个基因,扩增结果理想。[结论]为庞大基因家族扩增条件的优化与选择提供了理论依据。     

SARS-COV结构蛋白N的核酸PCR扩增

[目的]探讨SARS-COV结构蛋白的PCR扩增条件。[方法]采用正交试验对SARS全基因组进行PCR反应筛选目标片段,确定退火温度、模板浓度、聚合酶量、引物浓度P、CR延长时间对于PCR反应的影响。[结果]结果表明,在退火温度55~60°C、模板浓度5 mg/ml加入1μl、DNA聚合酶加入0.25μl、引物浓度25 pmol/LP、CR反应时间为60 s时,DNA回收量最高,为4.37μg。[结论]该研究为SARS冠状病毒核酸的转录和复制提供科学依据。     

菊芋凝集素基因组片段的PCR扩增及克隆

通过PCR扩增 ,获得了菊芋凝集素基因 (hta)的编码区基因组片段hta - g。DNA序列分析表明 ,PCR产物长 70 2bp ,包括 444bp的编码区序列 ,编码区被一个 2 5 8bp的内含子分成 2个长度分别为 2 1 0bp及 2 34bp外显子 ,内含子边界序列符合GT/AG规则。与htacD NA序列的比较分析表明 ,hta - g的编码区序列与htacDNA序列高度同源 ,同源性在 93%～98%。     

利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36的初步研究

通过优化PCR扩增体系,利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36。结果表明,利用扩增长片段的LA Taq酶,结合使用GC buffer I,以及热启动PCR技术和两步法扩增,在退火温度为62℃和62.8℃时,得到了扩增效率较高,特异性高的16.5kb目标带。     

简并寡核苷酸引物PCR扩增单细胞基因组的影响因素研究

[目的]研究影响简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)扩增单细胞全基因组的因素。[方法]以单个人外周血淋巴细胞为材料,进行DOP-PCR,研究新鲜细胞与冷藏细胞及采用新鲜和冻存的细胞裂解物为模板对扩增产物的均匀性及特异性的影响。[结果]以新鲜的淋巴细胞为模板与以冷藏的淋巴细胞为模板相比,扩增产物的均匀性相当,特异性上新鲜细胞较好。细胞裂解后立即进行扩增的效果在产物的均匀性及特异性方面均明显优于冻存的细胞裂解物。[结论]对单细胞应用DOP-PCR方法进行全基因组扩增时,应尽量选取新鲜细胞进行裂解,裂解后避免冻存以保证扩增的均匀性及特异性。