紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。     

紫茎泽兰热激蛋白70基因的克隆与序列分析

热激蛋白70(HSP70)与植物的抗逆性密切相关。根据其他植物hsp70的保守性区域设计特异性引物,采用RT PCR方法从紫茎泽兰Ageratina adenophora中克隆到hsp70基因全长cDNA序列。序列分析结果表明,该cDNA包含1个 1 938 bp的开放阅读框(GenBank登录号:FJ598132),共编码645个氨基酸,相对分子质量为70.58 kDa,命名为hsp70.58。该蛋白包含真核生物HSP70高度保守的三个家族标签和末尾基序EEVD。运用实时定量PCR 分析,探测到hsp70.58在mRNA水平上皆能被高温和低温诱导表达,说明该基因属于诱导型hsp70基因。     

茶树小分子量热激蛋白基因CsHSP17.2的克隆与表达分析

[目的]进一步了解茶树小分子量热激蛋白基因CsHSP17.2在逆境胁迫条件下的分子生物学功能.[方法]利用RT-PCR技术从茶树‘迎霜’中克隆得到CsHSP1 7.2基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码蛋白,通过Real-timePCR分析其表达模式.[结果]该基因开放阅读框长度为453 bp,编码150个氨基酸,蛋白质相对分子质量为17.2×10a,理论等电点5.56;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;被定位于细胞质中.系统发育树分析表明,茶树CsHSP1 7.2与水稻(GenBank登录号:P27777)和花生(ABC41131)的进化关系较近,属于小分子量热激蛋白基因家族第Ⅰ亚族.qRT-PCR分析发现,茶树CsHSP17.2属于组成型基因;高温(38℃)处理1h能显著提高CsHSP17.2 mRNA的相对表达量(P＜0.05);干旱(100 g·L-1 PEG 6000)、高盐(200 mmol· L-1 NaCl)和外源脱落酸(200 mg· L-1 ABA)处理条件下,该基因的转录水平均出现不同程度的上调.[结论]克隆得到茶树‘迎霜’小分子量热激蛋白基因CsHSP17.2,其在花中表达量最高,且响应高温、干旱、高盐和外源脱落酸胁迫.     

叶用莴苣热激蛋白90（LsHsp90）基因的克隆及其在热激下的表达

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE 技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA 中克隆LsHsp90 cDNA 序列。通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp,开放阅读框2 097 bp,编码698个氨基酸,推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明,LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域,并与拟南芥（AY081302.1）、紫茎泽兰（EU269070.1）等多种物种的热激蛋白90高度同源;进化树分析表明,LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因（EU269070.1）聚为一类。qRT-PCR分析表明,37℃热胁迫下,该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达;42℃高温胁迫下,热敏品种S106 中下调表达,而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90,该基因具有已知物种Hsp90基因的特征,该基因在热胁迫下有不同的表达特征,预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。     

叶绿体小分子量热激蛋白与植物光系统保护研究进展

对叶绿体小分子量热激蛋白的研究进行了简要的回顾和总结。详细介绍了植物遇到冷、热胁迫时,叶绿体小分子量热激蛋白对光合系统的保护;初步分析了叶绿体小分子量热激蛋白与植物的耐热性和耐冷性关系及其潜在的作用方式。     

沙芥幼苗叶片小热激蛋白基因的克隆与表达

在对转录组和蛋白组数据联合分析的基础上,通过RT–PCR方法克隆得到沙芥幼苗叶片2个小分子热激蛋白基因PcHSP26.5和PcHSP17.8,运用生物信息学软件分析它们的核苷酸和编码蛋白,通过Real–time PCR分析其在高温、低温、NaCl、ABA和干旱复水胁迫下的表达模式。PcHSP26.5和PcHSP17.8开放阅读框分别为699 bp和462 bp,分别编码282和153个氨基酸,其中PcHSP26.5包含1个内含子。PcHSP26.5、PcHSP17.8的相对分子质量分别为26 480、17 490,理论等电点分别为6.36、5.99;均无跨膜结构与信号肽位点,属于亲水蛋白。亚细胞定位预测和进化树分析表明,PcHSP26.5主要定位于线粒体中,属于MⅡ亚族;PcHSP17.8主要定位于细胞质中,属于CⅠ亚族。实时荧光定量PCR结果表明：高温胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在1 h达到顶峰,之后下降;低温胁迫下,沙芥PcHSP26.5基因的相对表达量在0.5 h达到顶峰,之后下降,沙芥PcHSP17.8基因的相对表达量在0.5~12 h内低于对照,24 h时出现上升趋势;NaCl胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量分别在 1 h和3 h达到顶峰,之后下降;ABA胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在2 h达到顶峰,之后下降;干旱复水胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在干旱9 d达到顶峰,复水后下降。     

大黄鱼热激蛋白cDNA克隆及系统发育分析

根据已报道的HSP基因序列（EMB登录号：AF506290），设计出特异引物，PCR扩增后测序，获得1．7kh大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体，高等动物编码的HSP在进化上紧密相关，形成一个显著群体，大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中，这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合，其中与非洲爪蟾的同源性最高（92．3％），也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析，可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础，同时对大黄鱼的品质改良和良种的选育有重要意义。     

大黄鱼热激蛋白cDNA克隆及系统发育分析

根据已报道的HSP基因序列（EMB登录号：AF506290）,设计出特异引物,PCR扩增后测序,获得1．7kh大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体,高等动物编码的HSP在进化上紧密相关,形成一个显著群体,大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中,这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合,其中与非洲爪蟾的同源性最高（92．3％）,也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础,同时对大黄鱼的品质改良和良种的选育有重要意义。     

迷宫栓孔菌热激蛋白基因的生物信息学与表达分析

为了探究迷宫栓孔菌（Trametes gibbosa）热激蛋白（heat shock proteins, HSPs）家族的功能及结构,对经木屑处理不同时间点的菌丝样品进行cDNA建库,然后根据转录组数据筛选该菌株的所有HSPs基因并进行生物信息学分析;针对HSP100家族进行基因克隆和序列结构分析,并利用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）对其在木屑处理下的表达量进行验证。结果如下：在迷宫栓孔菌中共筛选出32个HSPs基因,其编码的蛋白分为5个亚类,分别为HSP100(2个)、HSP90(2个)、HSP70(7个)、HSP60(1个)和小分子热激蛋白[small HSPs(sHSPs),20个],它们在菌体生长调控中具有蛋白翻译后修饰、蛋白质折叠、伴侣蛋白等重要功能。这些HSPs都为疏水蛋白,不同亚类的HSPs理化性质有所差异。HSP100由N-端、核苷酸结合域1(nucleotide-binding domain 1, NBD1)、NBD2、2个NBDs间...     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

花楸树热激蛋白SpHSP70-2基因的克隆及表达分析

探究花楸树响应高温胁迫的分子机制,为遗传改良和耐热品种的选育提供基础,依托花楸树叶片转录组测序数据,采用反转录PCR（RT-PCR）方法克隆得到HSP70家族中的1个基因,命名为SpHSP70-2,同时对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对其组织特异性和应答高温胁迫的表达模式进行了分析。结果表明,经克隆得到的SpHSP70-2基因与花楸树叶片转录组测序数据的基因序列一致,SpHSP70-2开放阅读框（ORF）长度为1 704 bp,编码567个氨基酸。SpHSP70-2蛋白具有HSP70特征结构域:核苷酸结合结构域（NBD）和底物结合结构域（SBD）;SpHSP70-2基因无内含子;SpHSP70-2二级结构中具有ɑ螺旋（32.63%）、延伸链（23.28%）、β转角（7.23%）和随机卷曲链（36.86%）;SpHSP70-2蛋白为疏水性蛋白,有11个跨膜螺旋,无信号肽;SpHSP70-2与同科的苹果、白梨的HSP70同源性最高,为90%以上;SpHSP70-2在花楸树的果实中表达量最大,在茎、根中表达量次之,在花中的表达量最小;在42℃高温胁迫处理下,SpHSP70-2表达量呈现先升高后下降趋势,在2 h时达到极值,随后表达量略缓慢下降,说明SpHSP70-2基因参与调控花楸树对高温胁迫的响应。研究结果为今后花楸树响应热胁迫的分子机制研究和引种驯化方面提供基础。     

仙客来热激蛋白基因HSP21.4植物表达载体构建及鉴定

试验以仙客来热激蛋白基因HSP21.4为材料,经PCR扩增的方法在目的片断两端添加SacⅠ位点,然后与植物表达载体pBI121连接,转化感受态大肠杆菌,经PCR和SacⅠ及XbaⅠ酶切验证,确定已将该热激蛋白基因连接到植物表达载体上,将重组质粒命名为pBI-CpHSP21.4,并采用冻融法完成了对pBI-CpHSP21.4质粒的农杆菌转化,为验证该热激蛋白基因的功能及转基因植物表达奠定基础。     

多子小瓜虫HSP70基因ORF的克隆及表达分析

热激蛋白(HSP)是生物适应环境温度变化的重要媒介分子,本试验中克隆了多子小瓜虫Ichthyophthirius multifiliis HSP70(Im HSP70)基因的ORF,采用荧光定量RT-PCR法,在水温为20、25、30℃的条件下检测了HSP70基因在多子小瓜虫幼虫、滋养体和包囊3个不同发育阶段的表达情况。结果表明:Im HSP70基因的ORF为1995 bp,预测编码为664 aa;Im HSP70蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主,空间构型包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域;与其他物种HSP70蛋白序列进行同源性比较发现,Im HSP70与螅状独缩虫Carchesium polypinum HSP70的同源性最高,为78.08%;Im HSP70与分类地位同为纤毛门的螅状独缩虫、嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila、变藓棘毛虫Sterkiella histriomuscorum的HSP70聚在一个分支;3种温度下幼虫的HSP70表达量均最低,20℃和25℃时,HSP70基因在滋养体中的表达量显著高于幼虫和包囊(P<0.05),而30℃时,HSP70基因在包囊中的表达量显著高于滋养体和幼虫(P<0.05);30℃时HSP70基因在包囊中的表达量显著高于25℃(P<0.05)。研究表明,试验所用多子小瓜虫的HSP70基因在30℃时仍大量表达,且能感染试验鱼,推测该虫株为热带型多子小瓜虫,HSP70基因在多子小瓜虫对抗外界高温环境中可能发挥着重要的作用。     

多子小瓜虫HSP70基因ORF的克隆及表达分析

热激蛋白（ HSP）是生物适应环境温度变化的重要媒介分子,本试验中克隆了多子小瓜虫Ichthyoph-thirius multifiliis HSP70（Im HSP70）基因的ORF,采用荧光定量RT-PCR法,在水温为20、25、30℃的条件下检测了HSP70基因在多子小瓜虫幼虫、滋养体和包囊3个不同发育阶段的表达情况。结果表明：Im HSP70基因的ORF为1995 bp,预测编码为664 aa; Im HSP70蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主,空间构型包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域;与其他物种HSP70蛋白序列进行同源性比较发现, Im HSP70与螅状独缩虫Carchesium polypinum HSP70的同源性最高,为78.08%; Im HSP70与分类地位同为纤毛门的螅状独缩虫、嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila、变藓棘毛虫Sterkiella histriomuscorum的HSP70聚在一个分支;3种温度下幼虫的HSP70表达量均最低,20℃和25℃时, HSP70基因在滋养体中的表达量显著高于幼虫和包囊（P〈0.05）,而30℃时, HSP70基因在包囊中的表达量显著高于滋养体和幼虫（P〈0.05）;30℃时HSP70基因在包囊中的表达量显著高于25℃（P〈0.05）。研究表明,试验所用多子小瓜虫的HSP70基因在30℃时仍大量表达,且能感染试验鱼,推测该虫株为热带型多子小瓜虫, HSP70基因在多子小瓜虫对抗外界高温环境中可能发挥着重要的作用。     

植物热激蛋白研究进展

论述了植物热激蛋白的研究进展,对植物热激蛋白的产生和分布,热激蛋白在温度逆境下的响应机制及其生理功能和基因表达调控等方面进行了概述,并提出了热激蛋白研究中存在的问题及今后的研究方向。     

玉米热激蛋白70基因对温度胁迫的响应

利用RT-PCR技术从玉米自交系H21叶片中克隆获得一热激蛋白70(HSP70)基因的完整开放阅读框,全长1 737 bp,编码578个氨基酸,命名为ZmHSP70。编码的氨基酸与其他作物比对分析表明,ZmHSP70与高粱中一推测的蛋白(SbHSP70,XP_002465635)同源性最高,达95%,与水稻中一推测的蛋白(OsHSP70,EAY89062)同源性达87%。半定量RT-PCR的结果表明,该基因明显受42℃热激诱导表达,热激2 h其表达量达最大值;4℃冷胁迫也能诱导ZmHSP70表达量增加,冷胁迫4 h,其表达量达最大值。ZmHSP70是一个受温度诱导的热激蛋白。     

云南切梢小蠹热激蛋白40基因的克隆与序列分析

[目的]克隆云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)热激蛋白40基因,并进行序列分析,得到该基因的特征。[方法]采用RACE克隆技术,获得云南切梢小蠹热激蛋白40基因,并对该基因进行分析。[结果]试验获得的基因序列长为1 205 bp,开放阅读框1173 bp,编码氨基酸序列390个,编码蛋白质的预测分子量为43.56 ku,等电点为7.35。该基因蛋白序列具有1个Amidation位点,2个天冬酰胺N末端糖基化位点,2个CAMP和CGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,7个N末端十四烷基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,1个RGD细胞附着序列,1个DNAJ-1结构域等热激蛋白40所具有的典型特征。[结论]通过同源性比对分析发现,云南切梢小蠹热激蛋白40基因与家蚕(Bombyx mori)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)和东亚飞蝗(Locusta migratoria)的热激蛋白40基因在氨基酸水平上一致性为20%~30%,它们的相似性均不高。虽然不同昆虫Hsp40在进化过程中具有高度的保守性,编码序列变异比较低,但是结构域差异与生物体适应外界环境有一定的关系。     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达

[目的]构建小麦热激蛋白60基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦热激蛋白60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90 KD。蛋白质电泳（SDS-PAGE）结果表明,表达的蛋白条带与预期的大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

泽兰实蝇对紫茎泽兰寄生及株高与繁殖性能的影响

为了解野外自然条件下泽兰实蝇(Procecidochares utilis Stone)对紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)的寄生特征,采用随机抽样调查和样方调查法,探讨了林下与空旷地的居民区、柏树林、松树林、桉树林和杂草地等5种不同生镜下的泽兰实蝇自然寄生率。结果表明:林下和空旷地的泽兰实蝇寄生率无显著差异。5种不同生镜下的泽兰实蝇寄生率存在显著差异,以桉树林最高,为60.5%,居民区次之,为46.2%,杂草地为32.5%,柏树林最低,为25.1%。泽兰实蝇寄生产生的虫瘿大多分布在紫茎泽兰植株较幼嫩部分,以距顶1~34cm虫瘿数最多,占调查总虫瘿数的72.2%。5种生镜下紫茎泽兰植株上的虫瘿个数均以结1~2个虫瘿为主,结3个及3个以上虫瘿的较少。从平均每瘿虫口数看,虫瘿大的平均每瘿虫口数多,虫瘿小的平均每瘿虫口数少。此外,泽兰实蝇寄生对紫茎泽兰的株高和有性繁殖力均无显著影响,说明泽兰实蝇寄生对紫茎泽兰的控制作用不明显。