胰岛素突变体合成中不对称PCR条件的探讨

在胰岛素定点突变体合成中，对不对称PCR反应中突变位点的引物和末端引物的比例以及退火温度进行优化。结果表明：PCR反应5′末端引物与突变引物的配比为50：1～100：1；第2轮PCR反应退火温度在65～70℃较为理想。     

轮叶党参RAPD分析的最佳PCR条件筛选

为了确定轮叶党参RAPD分析的最佳PCR条件进行了各种反应条件实验。结果表明：PCR反应时，总反应液20μL中基因组DNA浓度为20ng，引物浓度为10pmol，退火温度为39.1℃和41.3℃，扩增次数在40次下出现可辨认的鲜明的谱带。由此，在上述条件下PCR反应的结果，49种引物中，用轮叶党参基因组DNA能够形成PCR产物并可确认的引物有20个，形成的总谱带数为77个，GC含量高（平均66.5%)形成的谱带也好。     

ARMS-PCR对棉花SNP分型的研究

[目的]在已知SNP的情况下,找到适合棉花SNP的简便验证方法.[方法]利用四引物扩增突变体系(tetra-primer amplification refractory mutationsystem PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)对槔花SNP分型进行验证.[结果]根据深圳华大基因已组装的棉花转录本做为参考,分别将新海21号和新陆中36号的转录组测序样品比对到参考基因,通过SOAPsnp技术检测样品的单核苷酸多态性.棉花海陆杂交亲本的38个单核苷酸多态性位点设计出的66组SNP引物进行验证.通过优化PCR反应体系,反应条件,调整内外引物浓度和PCR体系的优化,从66组引物中扩增出11组引物,得到了良好的分型效果.[结论]四引物扩增受阻突变体系聚合酶链式反应是一种简单快捷而有效的SNP基因分形方法.     

应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenase gene, 6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。     

芋疫霉菌的巢式PCR检测

【目的】建立芋疫霉菌快速、准确的PCR检测技术,为芋疫病流行规律监测和综合防控提供科学依据。【方法】根据芋疫霉菌与其他疫霉菌种类Ypt1基因序列差异,设计了1对芋疫霉菌PCR检测特异引物PCOF/PCOR,并对该引物的特异性、灵敏性和应用性进行了验证。【结果】在优化的反应体系与扩增条件下,PCOF/PCOR引物能特异性地从芋疫霉菌基因组DNA中扩增出1条172 bp的条带,而其他供试病原菌均无扩增条带。在25μL PCR反应体系中,PCOF/PCOR引物对芋疫霉菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg,而以疫霉菌Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R为第一轮引物,PCOF/PCOR为第二轮引物,进行巢式PCR扩增,能检测到10 fg芋疫霉菌基因组DNA,检测灵敏度提高了10 000倍。采用巢式PCR,可从芋疫病发病的叶片和未显症叶片组织中检测到芋疫霉菌,检出率分别为100%和57.5%。【结论】所建立的巢式PCR可应用于芋疫霉菌的快速、特异和高灵敏度检测。     

2种不同方法制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体适配子的ssDNA文库的比较

体外合成全长为71个碱基的随机ssDNA文库,采用SELEX技术,以玉米赤霉烯酮单克隆抗体为靶蛋白,微孔板为筛选介质进行筛选。通过对比不对称PCR法和生物素-链霉亲和素磁珠2种分离方法制备ssDNA文库的效果,确定了以生物素-链霉亲和素磁珠分离方法制备ssDNA为优选方法。ssDNA文库扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应条件为:退火温度50℃,循环数20次。不对称PCR退火温度为50℃,最佳循环数为30次,引物Ⅰ与引物Ⅱ的比例为80∶1。此反应条件下,ssDNA文库PCR扩增的条带清晰、稳定、特异性高。生物素-链霉亲和素磁珠法为有效筛选特异性强的玉米赤霉烯酮单克隆抗体适配子的优选技术方案,为适配子SELEX筛选奠定基础。     

四引物扩增受阻突变体系PCR及其在水稻遗传育种研究中的应用

介绍了四引物扩增受阻突变体系PCR技术,阐述了该SNP基因分型技术的引物设计和反应体系优化方法,综述了该技术在水稻遗传育种研究中的应用,旨在推广这一简单、高效SNP基因分型技术。     

One tube nested-PCR在SNP基因型分型中的应用

nested–PCR是一种在普通PCR基础上发展起来的专门用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。结合nested–PCR技术在水稻中检测SNP的研究,以1个水稻香味基因Fgr和3个稻瘟病基因Pi–ta、Pi9、Pigm为例,把nested–PCR的4条引物同时加在一管PCR反应中进行扩增,在其序列内针对SNP位点设计功能标记,用来扩增含有突变位点的DNA片段。通过优化引物浓度梯度和改良反应程序,达到了一步快速检测SNP基因型的目的。     

牦牛乳球蛋白基因5'调控区的分离、克隆及序列分析

根据文献设计1对PCR引物,寡聚核苷酸序列上游引物为5′-gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3′,下游引物5′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′.经68℃退火及30轮循环的PCR程序后扩增出长度为1447 bp的DNA片段,将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆到pMD18-T Vector后进行序列测定.序列分析结果表明,牦牛乳球蛋白基因5′调控区与文献报道的奶牛该基因同源性为97.65%,突出的碱基差异为牦牛乳球蛋白基因5′调控区发生了1个位点连续3个碱基的缺失突变和另一位点1个碱基的插入突变.该研究也为开展以牦牛乳球蛋白基因5′调控区为启动子的乳腺生物反应器研究准备了条件.     

放线菌快速检测方法的反应体系及反应条件的优化

[目的]研究放线菌快速检测方法的PCR反应体系及反应条件的优化。[方法]以5种存在于16SrDNA序列中的放线菌特异性的特征序列为引物,通过对PCR反应体系和反应条件的优化,建立最佳扩增体系及反应条件,并对供试菌株进行测定,以验证该方法的可靠性。[结果]所采用的特异性引物能够有效检测出特定类群的放线菌,从而达到快速检测不同类群放线菌的目的。[结论]该方法可用于放线菌的快速检测,为放线菌的分类鉴定研究提供参考。     

生物技术在基因诱变中的应用

详细介绍了生物技术在基因诱变中的种类、诱变原理及应用情况.其中,定位诱变包括Kunkel法、PCR定位诱变、人工合成新基因,随机诱变包括使用致突菌株、易错PCR、DNA改组技术、随机引导重组、交错延伸技术.还介绍了一种利用DNA中原子结构变异产生定向性变异的新方法.     

应用通用转录器工程获得优良农艺性状的转基因水稻

为得到农艺性状或抗逆性优良的转基因水稻材料,克隆了粳稻品种中花11(ZH11)的通用转录因子TATA框结合蛋白TBP(TATA binding protein)基因,通过随机诱变PCR的方法,获得104个突变子;利用农杆菌介导的方法将这些突变的TBP基因分别转化到中花11中,获得了水稻TBP基因不同突变的转基因水稻。将其移入大田,收获种子并在T1、T2代进行农艺性状的考察,对产量性状改善的转基因材料进行百草枯、甘露醇、氯化钠的胁迫处理,观察并记录表型变化。最终获得了1个具有较高产量同时具有一定非生物逆境抗性的突变体材料。     

大豆EMS化学诱变处理条件分析

[目的]为使EMS(甲基磺酸乙酯)诱变效果最佳,获得高质量的诱变材料,其诱变时间和诱变浓度等基本条件分析是诱变处理的前提。[方法]采用化学诱变剂EMS处理大豆品种长豆18和黑豆品种长豆006,分析获得不同大豆品种的适宜诱变条件。试验设置2个品种、3个EMS浓度(0.2%、0.5%、0.8%)和3个诱导时间(4、8和12 h)共18个处理,以致死量达到50%为标准。[结果]大豆品种长豆18的适宜诱变条件以浸种4 h,处理浓度0.5%EMS,诱导时间8 h和浸种4 h,处理浓度0.5%EMS,诱导时间12 h处理最优;黑豆品种长豆006的适宜诱变条件为浸种4 h,处理浓度0.5%EMS,诱导时间8 h。[结论]大豆EMS化学诱变可适当提高致死剂量浓度作为大田处理浓度。     

小麦航天诱变育种效果研究

利用返回式卫星搭载两个小麦品种(系)种子进行空间诱变处理,对SP2代农艺性状变异效果进行了分析。结果表明,两个品种(系)的农艺性状均发生了变异,但株系内变异多数为不显著。两个品种(系)的诱变率和性状的变异方向存在差异,豫农201的诱变率高于大粒1号;大粒1号变异株系的性状指标多数为增加,豫农201变异株系的性状指标多数为减少。性状间的诱变率具有差异,株高和粒重的诱变率明显高于其它性状。     

作物诱变育种及突变体鉴定与筛选研究进展

简述了作物的诱变机理、诱变技术和分子标记技术、突变体的鉴定与筛选技术,结合近年来国内外诱变育种的研究进展,分析了作物诱变育种的主要发展方向,并展望了诱变育种的广阔前景。     

牛Dgat1基因高GC含量片段的定点突变

将扩增出的1.8 kb目的片段克隆入pUCm-T载体,以构建好的质粒为模板进行突变反应。DpnⅠ酶切反应产物,去除甲基化及半甲基化DNA模板。酶切产物经纯化后转入DH5α感受态细胞,提取质粒测序。结果表明,双核苷酸碱基AA突变为GC,成功得到突变载体。将定点突变试剂盒方法加以改进,完成GC含量高达69.5%模板定点突变,改进后的方法操作简单、经济实用,有效地解决了高GC含量模板难突变难题。     

太空诱变薰衣草精油成分分析鉴定

[目的]利用太空船搭载薰衣草（Lavandula angustifolia Mill.）种子,通过栽培试验观测其诱变后代搭载效应,探讨太空环境对薰衣草精油品质的诱变效应.[方法]搭载诱变材料为薰衣草7426-2种子.[结果]搭载后薰衣草植物学性状差异明显,初选出19份诱变材料,精油主要化学成分基本没有改变,但其含量有明显的差异,19份诱变后代中精油化学组分达到或优于标准的有6种,分别为L07-3、L07-9、L07-11、L07-12、L07-14、L07-16.[结论]该研究可为薰衣草太空诱变育种及种质创制提供新的理论依据,为今后薰表草品种改良及产业持续发展提供优质品种.     

一株产油酵母菌的微波诱变选育

以产油酵母菌Y1为试验菌株,通过对出发菌株Y1的最佳微波诱变时间确定、诱变后菌株初筛和复筛后得到一株突变菌株Y13,测得Y13的油脂产量4.39g/L、油脂含量22.09％,比出发菌株Y1油脂产量2.11 g/L、含油量9.6％明显提高.因此,菌株Y13可作为后续摇瓶发酵产脂研究的试验菌株.     

一种简单高效的水稻体细胞诱变育种新方法

多样化种质资源的利用对于培育高产和理想农艺性状水稻品种显得非常重要.在本研究中,通过研究继代时间、2,4-D浓度和不同外植体对诱变和分化频率的影响,建立了幼穗为外植体、继代培养时间为3个周期(约75 d)以及2,4-D的最佳诱变浓度为4.0 mg/L的体细胞诱变育种方法.然后利用该方法诱变杂交水稻亲本株1S和中9B,分别成功选育了优良矮化突变株系SV14S和SV9B,为后续的杂交育种提供了优质种质资源.这些育种成果的取得进一步证实了该水稻体细胞诱变育种方法是一种简单高效的新型育种方法.     

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究(英文)

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。