猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞旋转培养制造猪瘟冻干苗的研究

为了克服猪瘟兔化弱毒乳免疫苗成本高,易污染的缺点,弥补采用常规猪肾细胞制造猪瘟弱毒疫苗的潜在致病危险性。本文成功的在犊牛睾丸细胞上连续增殖猪瘟化弱毒,特别是利用次代或二代细胞进行转瓶堵养,收获的猪瘟兔化弱毒其毒价稳定,细胞不易老化脱壁。现已制成猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞培养冻干疫苗,生产工艺简单,成本较低。疫苗对猪的免疫原性良好,免疫期一年以上。性能稳定,在-15℃可保存13个月,4℃保存半年以上,25℃也可保存14天。经7691头猪的免疫接种试验,证明本苗安全,无一死亡,个别猪有反应,其反应率仅为0.74%。     

猪瘟兔化弱毒的研究 Ⅱ.猪瘟兔化弱毒对猪的安全性

我们自1954年3月开始,研究猪瘟弱毒疫苗。关于猪瘟兔化弱毒(简称兔化毒)连续通过兔体430代的变化情况,及其对兔感染性的有关试验结果,已发表于第一报。本文报告兔化毒对猪的安全性试验的各项结果,试验证明连续通过兔体后,已充分减弱了它对猪的致病力,注射我国各地猪只,都极安全有效。     

关于猪瘟兔化弱毒疫苗的探讨

猪瘟作为一种严重危害养猪业的毁灭性传染病,为畜牧业的发展造成了一定的阻碍,猪瘟病毒兔化弱毒株具有优良的免疫原性,在我国使用比较广泛.文章探讨了猪瘟兔化弱毒疫苗的生物学特性,包括其遗传特性、对猪的免疫原性、对猪的安全性,猪瘟兔化弱毒疫苗的应用.     

猪瘟兔化弱毒疫苗与我国近年猪瘟野毒的免疫保护相关性试验

２批猪瘟兔化毒睾丸细胞苗分别来自两家兽医生物药品厂，各分别免疫接种猪只，随后以５株猪瘟病毒野毒分别攻击，疫苗接种猪完全存活，对照猪完全死亡。此５株野毒分离自国内不同地区，并皆已经过细致的鉴定，以免疫荧光技术对猪扁桃体进行了活体检查，各对照猪材料上能在攻击后一周时出现病毒，而疫苗接种猪在整个观察期间未出现病毒，据此，显然可见猪瘟兔化毒细胞苗在预防国内猪瘟上极有效力     

猪瘟兔化弱毒疫苗的研究概况

猪瘟病毒兔化弱毒株因其优良的免疫原性,成为我国至今唯一使用的猪瘟疫苗株。本文就猪瘟兔化弱毒株的生物学特性、猪瘟兔化弱毒组织疫苗和细胞疫苗的研制以及疫苗的应用进行了综述。     

接种猪瘟兔化弱毒株的永生化猪血管内皮细胞传代情况研究

在传至70代的永生化猪血管内皮细胞接种猪瘟兔化弱毒,72 h后收取细胞上清液并对处理的细胞进行传代培养,分别检测第70、75、80、90、100、105代接毒细胞中病毒,观察各代细胞的生长情况。结果表明,接种猪瘟兔化弱毒后20代(第90代永生化猪血管内皮细胞)的细胞与正常的形态相似,但传至接毒后35代(第105代永生化猪血管内皮细胞)时,细胞稍有拉长现象。各代次细胞中都有猪瘟兔化弱毒的检出。本研究为永生化猪血管内皮细胞生产猪瘟兔化弱毒疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法.该方法检测的敏感度达1.20×10⁵拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%～0.39%,批间变异系数为0.32%～0.61%.应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异.结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量.     

猪瘟兔化弱毒疫苗适应家兔的分子机制

正病毒经过多次传代后可以获得对体外培养细胞或异种宿主的适应性。例如,经过多次传代后获得了适应细胞的丙型肝炎病毒(HCV),其滴度比亲本病毒高约1 000倍。病毒的囊膜蛋白在病毒对细胞或异种宿主的适应性中起重要的作用,如HCV囊膜蛋白上3个位点的突变使其获得了对小鼠肝细胞的适应性。许多弱毒疫苗株是将病毒在细胞或异种宿主上多次传代培育而成的,如猪瘟兔化弱毒疫苗、山羊化兔化牛瘟弱毒疫苗和马传染性贫血弱毒疫苗等。这些疫苗为我国猪瘟的防控及牛瘟和马传染性贫血     

对稳定和提高猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞复制毒毒价的探讨

笔者1982年开始用犊牛睾丸细胞繁殖猪瘟兔化弱毒,7年来进行了各种对比试验,说明用犊牛睾丸细胞复制猪瘟兔化弱毒是成功的,为我国提供防治猪瘟病的疫苗开辟了新的制造手段。不但可以保证疫苗质量,并能确保安全,提高预防效果,降低成本。几年来,经过试产和扩大再生产,截至1988年底,共生产犊牛睾丸细胞苗5000万多头份     

猪瘟兔化弱毒毒种保存期试验

本试验对３个代次不同冻干日期的猪瘟兔化弱毒进行了兔体最小感染量测定,并对经猪瘟兔化弱毒Ｆ４７６代毒繁殖冻干的两批猪瘟兔化弱毒Ｆ４７９代毒进行了免疫原性鉴定。结果表明,猪瘟兔化弱毒在－７０℃条件下保存１４年、１５年、２９年,其兔体最小感染量均无明显改变;繁殖的两批猪瘟兔化弱毒的最小免疫量均为１０＾－５稀释１ｍｌ,符合《兽用生物制品规程》规定。     

用异源细胞(体外培养的羊睾丸与羊肾细胞)培养猪瘟病毒试验

针对目前使用猪肾细胞生产猪瘟弱毒疫苗存在来自组织本身污染带来的潜在致病危险的情况,我们试验了用羊羔睾丸与肾细胞来生产猪瘟病毒。结果表明:猪瘟兔化弱毒适应羊羔睾丸与肾细胞,呈温和感染而不致细胞病变,可连续收获多次,产毒较高,毒价稳定。将原代培养的羊羔睾丸、肾细胞传一代后,细胞更加适应体外环境,维持时间较长,经再接毒后产毒效果仍然很好,均可达生产要求。由此看来,用羊羔睾丸、肾细胞代替猪肾细胞生产猪瘟病毒苗头很好,若进一步试验成功,可考虑用于生产。     

兔化猪瘟弱毒山羊体一代反应苗的应用

兔化猪瘟弱毒冻干苗在未大批生产供应防疫使用之前,兔化猪瘟弱毒山羊体、绵羊体或牛体反应苗在我省和兄弟省区曾经有效地用于防制猪瘟,在控制和消灭猪     

猪瘟兔化弱毒疫苗的临床试验

1效力 用我国生产的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞苗免疫无猪瘟抗体及抗原的易感猪，每头皮下注射1头份，14天后分别攻击猪瘟野毒，每头皮下注射猪瘟血毒2毫升。结果表明，猪瘟弱毒细胞苗对9株野毒均具有坚强的保护力，免疫组100％保护，对照组76．5％死亡。以猪瘟荧光抗体法（HCFA）检查，     

猪瘟兔化弱毒的研究——Ⅱ 猪瘟兔化弱毒对猪的安全性

通过四年多的试验证明,猪瘟病毒由于连续通过兔体传代适应后,对猪的致病力,发生了明显的变化,通过兔体67代以前,对吃乳猪和断奶猪均不安全有死亡,用91代以后,165代以前各代兔化毒,在各农场试验,对断奶仔猪的死亡率降低,毒力减弱;但对某些少数体弱及饲养条件欠佳的吃乳猪群,仍会因反应诱发并发病死亡。到214代以后用于各龄仔猪包括生后10—40天的吃乳猪,已极安全,无可见反应,不影响发育。自1957年在全国广泛应用,平均反应率约1％,死亡率约0.1％(包括各种原因死亡在内,此时种毒为300代以后),说明兔化毒对猪的毒力已充分减弱。从其对猪的毒力演变过程来说,毒力减弱是随通过兔体传代数增加,而逐渐发生变化的。本试验还进一步证明了兔化毒毒力减弱后的稳定性,这株病毒虽连续回归通过易感仔猪6代,对生后15天的吃乳猪仍很安全。可以说,对猪的毒力并未增强,即使大量静脉注射仔猪也未发生可见反应。兔化毒免疫猪,不排泄病毒,猪体内也不长期保毒,与健康猪同群饲养,并不发生接触感染。免疫生后10—40天的吃乳猪,不影响其发育,初步观察对怀孕22天—3.5月的母猪,不发生流产,正常产仔。各省区在应用期中,也曾仔细观察兔化毒对吃乳猪和仔猪的安全性,未报告有什么不良反应产生。河南、陕西曾用以接种生后3天的吃乳猪,也没有什么反应,发育正常。不论根据实验室和在全国广泛实践应用的结果,均证明猪瘟兔化毒对猪的毒力已显著减弱,而对猪的免疫力仍很坚强,与国际文献所报导的其他各国应用的猪瘟弱毒株相比,品质是优良的。可以说是一株理想的猪瘟活毒疫苗弱毒株。从1956年开始,先后供给苏联、越南、匈牙利、罗马尼亚、保加利亚及朝鲜人民民主共和国等国应用,已分別取得控制或消灭猪瘟的良好效果。     

猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法研究进展

猪瘟兔化弱毒(HCLV)虽可在多种细胞上生长,但不产生细胞病变,这使得猪瘟疫苗的效价评价工作变得较为困难。目前,家兔热反应是HCLV病毒效价测定和CSF疫苗成品效力检验的主要方法。然而,HCLV所致的兔热反应存在个体差异大和测定时间长等问题,迫使人们寻求新的更为快速、敏感和精确的效力检验替代方法。笔者就近年来猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法的研究进展做一综述。     

猪瘟兔化弱毒间接免疫荧光鉴定方法的建立

为快速有效测定猪瘟疫苗病毒含量,建立了猪瘟兔化弱毒(HCLV)间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与兔体定型热试验方法进行了初步比较。试验结果表明,以冷甲醇固定ST细胞,将所选猪瘟活疫苗检验用阳性血清1:40倍稀释、荧光二抗1:32倍稀释时,IFA检测HCLV感染的ST细胞清晰、特异,检测猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒感染细胞阴性。对不同猪瘟疫苗半成品的检测结果显示,IFA测定半数组织感染量(TCID50)与兔体定型热试验测定兔体感染量(RID)具有较好的相关性,其拟合曲线为RID/m L=2.783TCID50/m L+110107.213。     

猪圆环病毒2型感染降低了猪瘟病毒弱毒苗的效能

猪瘟弱毒苗对于防控猪瘟病毒感染具有重要的作用,猪瘟弱毒苗在很多猪瘟流行地区广泛地应用。这个研究的目的是研究猪圆环病毒2型（PCV2）感染是否影响兔化猪瘟疫苗（LPC）的免疫效果。实验用18只6周龄的猪,这些猪全部通过剖腹产方式产出且出生后不能吃初乳,这些猪被随机分为四组。     

新生仔猪注射猪瘟兔化弱毒苗效果观察

为进一步验证新生仔猪哺乳前后注射猪瘟兔化弱毒苗的免疫效果,笔者继1986年测定抗体效价之后,于1987年4月在通渭县什川乡进行野毒攻击试验。结果报告如下: 一、材料 1.试验猪选自本省通渭县什川乡农民饲养的健康杂交母猪7头,于分娩前30天注射猪瘟兔化弱毒苗,每猪注射1头份。然后将其所产59头仔猪供试验用。     

猪瘟兔化弱毒组织培养疫苗的研究——用羔羊肾和羔羊睾丸细胞培养物繁殖弱毒和制备疫苗

用仔猪肾细胞培养物制备的猪瘟兔化弱毒(简称弱毒)疫苗,对猪具有良好的免疫原性,在国内已大量生产和使用。但是,用仔猪肾细胞培养物培养时,弱毒的毒价不够稳定,另外,使用仔猪肾细胞培养制备疫苗,仔猪有感染潜在致病力的各种致病微生物的可能,特别是对仔猪来源控制不严时有混入