松材线虫Bxpel2基因的克隆及RNA干扰载体构建

[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体.[方法]通过Trizol 法提取松材线虫总RNA,反转录合成cDNA,设计带T₇启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以cDNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况.[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至pMD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·mL^-1和1.152 mg·mL^-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制.[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础.     

利用PMI选择标记进行杨树转基因体系的研究

[目的]利用不同于抗生素的PMI为选择标记基因的遗传转化体系,对杨树进行双抗虫基因(Bt和CpTI)的转基因研究.建立杨树以PMI为安全标记基因的转基因体系,为安全、高效的林木转基因育种研究提供实验依据.[方法]选择已有的转CpTI抗虫基因(利用Km^r选择标记获得)的美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus ×euramericana ‘Nanlin895’)为受体材料,对杨树叶片、叶片分化芽、茎段生根的甘露糖敏感性等筛选优化,采用农杆菌介导的方法进行双抗虫基因的研究.[结果]较为适合的杨树叶片筛选培养基为:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1;叶片分化芽筛选培养基为:甘露糖10 g·L^-1和蔗糖20 g·L^-1;茎段生根筛选培养基:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1.在此基础上,获得了转Bt和CpTI双抗虫基因的植株8株.[结论]初步建立了以PMI为安全标记基因的杨树转基因体系:确定了PMI筛选的最适选择压,成功构建了含PMI选择标记基因的植物抗虫表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化最终获得了转双抗虫基因植株.     

miR396在落叶松体细胞胚胎中的功能研究

[目的]探讨miR396在落叶松体细胞胚胎发生中的功能.以期该研究能为解决体胚发育中子叶畸形胚与生根率低的问题提供新的视角,同时也为进一步揭示体胚发育的分子调控网络做基础铺垫.[方法]构建pre-miR396超表达载体,通过农杆菌介导侵染,将pre-miR396转入落叶松胚性细胞中,筛选稳定抗性细胞系.在DNA与RNA水平上,对抗性细胞系进行的鉴定、检测,同时统计比对其与野生细胞系间发芽率、叶片数目以及生根率的差异.[结果]在抗性细胞系基因组中,扩增出HTP与miR396的特异性片段,且无农杆菌Virg基因片段.RNA表达水平上,抗性系pre-miR396与miR396表达皆增加,而靶基因LaGRFs的表达量下调.统计表明抗性系胚的发芽率、生根率、叶片数目畸形率分别为70.60%、0.60%、37%,而野生型分别为92.50%、10.55%、4%,抗性系胚的发芽率、生根率显著降低(Sig.=0.000),叶片数目畸形率显著增加(Sig.=0.000).[结论]miR396在落叶松体细胞胚胎发生过程中,可能通过负调节靶基因LaGRFs的表达或者通过LaGRFs影响与它相互作用的基因,参与体胚子叶原基细胞代谢,从而影响了子叶与叶片的发育;通过负调节LaGRFs或者其它与根部发育相关的靶基因,影响了根端分生区细胞的活动,参与调控根的发育.     

苹果属无融合生殖SERK1基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为探讨苹果属植物无融合生殖分子机制。[方法]以苹果属平邑甜茶及杂种后代33#为试材,以苹果基因组CDS序列设计引物,通过PCR扩增技术克隆出SERK同源基因的cDNA全长序列,命名为MhSERK1和MhdSERK1(GenBank登录号JQ231273和JQ231272),利用实时定量RTqPCR的方法检测了这两个基因在平邑甜茶和杂种后代各组织和器官中的表达模式。[结果]序列分析显示MhSERK1和MhdSERK1编码区序列全长为1 899 bp和1 881 bp,分别编码632和626个氨基酸,其氨基酸序列与其他植物的SERK1同源基因所编码的氨基酸同源性都在80%以上,特别是与葡萄科龙眼品种同源性最高,高达92.56%,与模式植物拟南芥、烟草等植物的SERK同源基因都具有很高的同源性。实时定量PCR结果表明,在平邑甜茶和杂种后代不同组织、花器官中SERK1基因的表达量存在差异,其中在子房中的表达量最高,在营养生长的组织中表达量很低,在平邑甜茶花蕾期的子房中表达量最高。[结论]推测该基因在平邑甜茶和杂种后代的生殖发育过程中可能发挥重要作用。     

新疆巩留县杏果实斑点病病原菌鉴定

[目的]鉴定引起新疆巩留县杏树果实斑点病病原菌,研究造成杏树果实病害的原因,为当地杏树防治工作提供依据。[方法]采用常规组织分离法分离得到罹病杏真菌菌株,利用传统形态学观察和分子系统学分析相结合的方式对所分离出菌株进行分类鉴定及其致病性检测。[结果]杏果病斑处的病原菌在显微镜下观察到分生孢子形态与经PDA培养基培养后观察到分生孢子形态均与Thyrostroma carpophilum（Lév.） B.Sutton所产生分生孢子一致;将分离获得的3株真菌的rDNA-ITS片段测序后与NCBI参考序列进行多重序列比对的结果显示,其序列与T.carpophilum一致性为100%;在基于ITS基因序列构建的系统发育树中,3株菌与T.carpophilum聚在同一分支。在接种了T.carpophilum后,杏果实和叶片均产生明显病斑并且从其所产生的病斑上再次分离到所接菌,满足柯赫氏法则。[结论]从新疆巩留县杏果实病斑处分离获得的3株真菌,经鉴定为引起杏穿孔病的病原菌T.carpophilum。这是该菌首次在该地区发现并报道。     

平榛ChWRKY28基因克隆及表达模式分析

[目的]研究平榛ChWRKY28基因序列特征及其在不同非生物胁迫下的表达规律.[方法]以平榛为试材,采用RACE-PCR方法进行基因克隆;利用实时荧光定量PCR方法检测基因在不同组织及不同非生物胁迫下的表达模式.[结果]表明:克隆得到的WRKY基因,全长1 342 bp,基因内部包含1个长963 bp的完整开放阅读框,编码320个氨基酸残基,命名为ChWRKY28.构建的系统发育树表明:该序列与拟南芥AtWRKY28及杨树PtrWRKY93的关系最近,相似性分别为49%和60%.基因表达分析表明:ChWRKY28在雄花序、雌花芽及茎中均有表达,但在茎部(皮)中的表达量高于雄花序和雌花芽中的表达量,具有组织表达特异性;低温、干旱及盐胁迫均能诱导ChWRKY28基因的表达,但受诱导程度存在差异.亚细胞定位分析结果表明:ChWRKY28蛋白分布在细胞核内,是一个核蛋白.[结论]推测ChWRKY28基因可能参与植物响应非生物胁迫的信号转导过程.     

基于树冠因子的林木竞争指数研究

[目的]以湖南省黄丰桥国有林场杉木纯林为研究对象,进行树木竞争指数的研究,基于Hegyi简单竞争指数的形式,提出包含反映树冠特征因子的树冠竞争指数。[方法]将树冠竞争指数和Hegyi简单竞争指数分别与胸径增长量进行相关分析。[结果]Kendall's tau-b系数、Spearman's rho系数和相关系数R²均显示树冠竞争指数与林木生长量的相关性高于Hegyi简单竞争指数。[结论]该结果表明树冠竞争指数与林木生长量有更强的相关性,可以更好地体现树冠在树木生长中的作用,能作为模拟林分生长量的依据。     

滇重楼种子内源激素含量与种胚长度和萌发的关系

[目的]通过研究滇重楼种子层积过程中不同阶段内源激素含量与种胚长度的动态变化情况来探讨种子休眠机理.[方法]应用酶联免疫吸附法测定不同阶段种子内激素含量.[结果]种子萌发过程中,脱落酸(ABA)含量由54.34 ng·g^-1·FW降至32.16 ng·g^-1·FW,赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)显著升高,吲哚乙酸(IAA)含量波动较大,但整体呈逐渐升高趋势,随层积时间延长,未萌发种子中ABA含量持续降低,GA含量与GA/ABA值持续升高,仍显著低于已萌动种子中激素含量(p<0.05);种子在层积42天后,种胚开始膨胀,胚率快速增加;相关性分析结果,内源激素含量及比值与种胚生长呈显著相关(p<0.05),其中,GA/ABA值对种胚生长的影响最大.[结论]种子萌发过程中仅ABA含量降低不足以解除滇重楼种子休眠,同期GA含量升高和GA/ABA值达到某一阈值时能有效的解除滇重楼种子的休眠和促进胚的发育;种子在层积40天左右后,由于各项激素的综合作用,滇重楼种子由休眠状态逐步转变为破除休眠状态和萌发状态.     

西南桦和尾巨桉凋落叶分解及其与土壤性质的相关性

[目的]探讨南亚热带西南桦和尾巨桉人工纯林的凋落叶分解动态及其与土壤化学性质之间的相关关系.[方法]采用原位分解袋法研究凋落叶的分解过程.[结果]表明:西南桦、尾巨桉人工林凋落叶分解系数分别为0.96 a^-1和0.88 a^-1.在为期12个月的分解试验中,2种凋落叶有机C含量在整个分解过程中呈逐渐下降趋势;全K含量和C/N比在分解前期迅速下降,之后趋于平缓;全N含量和全P含量在整个分解过程中呈逐渐上升趋势;2种凋落叶N/P比则呈先升高后下降的趋势.无论是分解前期还是分解后期,凋落叶质量损失与N含量均呈显著正相关(前期R=0.877;后期R=0.855),与C/N均呈显著负相关(前期R=-0.735;后期R=-0.697).与尾巨桉林地土壤性质相比,西南桦凋落叶分解提高了林地0~10、10~20 cm土壤的有机C、全N、全P、全K、N/P,对2030 cm土壤有机C、全K、pH值、C/N、N/P则未产生显著影响.相关分析表明:凋落叶初始有机C含量与土壤有机C、全N、全P、全K、N/P显著相关;凋落叶初始全N含量与土壤全N、pH值、C/N显著相关.[结论]凋落叶的养分含量与土壤养分的关系紧密;与尾巨桉相比,西南桦凋落叶的养分含量明显较高,分解速率更快,释放到土壤中的养分也更多.     

长白山典型森林土壤黑碳含量及不同组分中的分布特征

[目的]通过实地采样对黑碳进行量化研究。[方法]利用相对密度分组方法探讨了长白山典型森林土壤黑碳含量及在不同有机碳组分中的分布特征。[结果]表明:黑碳(BC)含量在表层(A₁₁)、亚表层(A₁₂)分别为6.39~16.55 g·kg^-1、1.44~6.16 g·kg^-1,随土壤深度的增加而显著下降(p﹤0.01)。在A₁₁、A₁₂层中,轻组有机碳(LFOC)平均含量分别为66.66 g·kg^-1、6.65 g·kg^-1,轻组黑碳(LFBC)平均含量分别为5.63 g·kg^-1、1.21 g·kg^-1,同时,LFBC/LFOC在A₁₂层(10.02%~34.89%)显著高于A₁₁层(6.99%~14.45%)(p﹤0.01);A₁₁、A₁₂层重组有机碳(HFOC)平均含量分别为49.16 g·kg^-1、36.55 g·kg^-1,重组黑碳(HFBC)平均含量分别为2.69 g·kg^-1、1.44 g·kg^-1,HFBC/HFOC在A₁₁层(3.36%~8.08%)和A₁₂层(3.21%~7.58%)之间没有显著差异(p>0.05)。另外,土壤中LFBC/LFOC显著高于HFBC/HFOC(p﹤0.01),LFBC/BC显著高于HFBC/BC(p﹤0.01)。[结论]长白山典型森林土壤中黑碳的含量、比例均较高;土壤表层(A₁₁)有机碳、黑碳含量及各组分有机碳、黑碳含量均高于亚表层(A₁₂),均随着土层加深而显著降低;轻组、重组有机碳中均含有一定比例的黑碳,黑碳主要分布在轻组分中;轻组、重组有机碳与组分中黑碳均显著相关,轻组中相关系数大于重组。     

白蜡虫ws基因RNAi载体构建及原核表达dsRNA

[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。     

杨树PIF基因家族成员表达模式研究

[目的]为探究光敏色素相互作用因子(PIF)基因在杨树生长发育中的功能。[方法]利用生物信息学方法预测了杨树基因组中的PIF基因家族成员并对各成员的基因结构、保守基序进行了系统分析;在此基础上,采用实时荧光定量PCR技术检测了PIF成员在不同组织及低温、干旱和Na Cl胁迫下的表达模式。[结果]表明:杨树基因组中至少含有10个Pt PIF成员,这些成员在进化上相对保守,均具有典型的b HLH结构域。基因表达分析显示:Pt PIF基因在杨树不同组织及不同非生物胁迫条件下存在明显的表达差异。[结论]杨树Pt PIF基因家族包含10个成员参与不同的生物学过程,研究结果将为深入解析杨树Pt PIF基因的功能奠定了基础。     

杨树PtRRI基因的组织特异性表达模式分析

[目的]模式植物在木本植物中鉴定的许多重要调控因子家族在木本植物中出现了基因家族成员扩张,但ARRs家族作为细胞分裂素响应调节因子在杨树基因组中成员数量反而减少,其在木本植物中如何行使功能需要进一步研究。[方法]本研究通过生物信息学构建PtRRI启动子与GUS融合表达载体,检测植物激素处理后PtRRI表达量和检测PPtRRI::GUS转基因植株在生根过程中GUS信号等方法,对杨树PtRRI基因的组织特异性表达模式进行分析。[结果]表明:PtRRI在杨树根部、形成层、木质部表达量相对较高,PtRRI转录受6-BA激素诱导,与其在不定根发育过程中激素调控下的表达相一致。[结论]PtRRI基因可能参与杨树的次级生长。     

巨桉EXP基因家族的生物信息学分析

[目的]本研究有助于了解EXP基因家族的基本特征,为深入研究其功能搭建平台。[方法]本研究对从巨桉(Eucalyptus grandis Hill)中筛选出35个EXP基因家族成员(Egr EXP1 Egr EXP35),利用生物信息学方法对其基因特征与表达模式进行综合分析。[结果]巨桉EXP基因分布在8条染色体之上,EXP蛋白均定位在细胞质膜上发挥作用,大多数的家族成员具有信号肽。巨桉EXP编码的蛋白质由α-螺旋、延伸链、无规卷曲、β-转角组成。进化分析结果表明,巨桉EXP蛋白与毛果杨(Populus trichocarpa) EXP蛋白的进化关系接近。35个巨桉EXP基因在巨桉未成熟木质部、成熟叶片、韧皮部、茎尖、木质部以及幼叶组织中表达模式存在显著差异。[结论]EXP基因家族各成员的表达模式不同,Egr EXP17、Egr EXP18可能在巨桉木材形成过程中起重要作用。     

中间锦鸡儿CiDR1的克隆及干旱胁迫下的表达分析

[目的]研究并了解中间锦鸡儿CiDR1基因功能及其对干旱胁迫的响应,为抗性育种提供候选基因。[方法]通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆CiDR1基因的c DNA全长,利用生物信息学分析软件对其基因结构及功能进行分析和预测。再通过qRT-PCR技术对干旱胁迫后的幼苗中的CiDR1表达模式进行研究。[结果]从中间锦鸡儿中克隆到CiDR1基因的c DNA全长共计4 297 bp,Gen Bank登录号为KP277100。生物信息学分析表明,预测的CiDR1蛋白序列中含有1 243个氨基酸残基,具有抗病基因特征结构域TIR、NB-ARC、LRR等,其等电点为6.35,不稳定指数为42.91,不具备信号肽,为非分泌蛋白,定位于细胞质中。定量PCR检测发现,CiDR1基因在幼年期的茎中表达量较低,在成年期的叶片中表达量较高;在干旱胁迫处理后的幼苗中,CiDR1表达水平有明显下降,表明该基因的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关。[结论]中间锦鸡儿在干旱胁迫后其根、茎和叶中CiDR1的表达均明显下降,表明CiDR1的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关,进一步研究发现CiDR1在根、茎、叶中的表达水平可能受发育阶段调控。     

麻竹笋转录组测序及苦涩味物质合成基因差异表达分析

[目的]研究避光处理对麻竹笋苦涩味物质合成相关基因表达的影响。[方法]利用Illumina HiSeq~(TM)2500平台对自然生长(CK)和覆土处理(EP)2种类型的麻竹笋进行转录组测序,并对差异表达基因进行分析。[结果]转录组测序共获得36.45 Gb原始数据,经组装去冗余处理得到53 388个Unigene,将所得Unigene比对到Nr、Pfam、COG、Swissprot、GO和KEGG数据库中进行功能注释,发现共有31 462条Unigene与其它物种的基因具有同源性。对CK和EP处理所测得的Unigene进行表达量的比较分析,筛选出1 846个差异基因,其中,在EP处理中上调表达基因998个,下调表达基因848个。由KEGG代谢通路分析发现,差异基因显著地富集在32个代谢途径中,其中,包含与苦涩味物质合成相关的糖酵解途径、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成途径等。进一步研究发现,参与麻竹笋芳香族氨基酸、单宁合成的PFK、ENO、PPY-AT/HPP-AT、LAR等酶基因在EP处理中表达量下降,荧光定量PCR验证结果与测序结果基本一致。[结论]避光处理抑制了苯丙氨酸、酪氨酸、单宁生物合成关键酶基因的表达,可能最终影响麻竹笋苦涩味物质的合成。     

杨树PtROP家族基因的表达分析与功能预测

[目的]为探究ROP基因在林木中的功能。[方法]本研究以杨树为模式,在全基因组水平上对ROP基因的家族成员、基因结构、保守结构域、氨基酸序列相似性及表达模式进行了分析。[结果]显示,杨树PtROP基因家族包含13个成员,不同成员间在进化上相对保守,均存在与GTP结合与水解相关的结构域。这些基因在不同组织、不同胁迫条件下的表达具有明显差异,说明它们参与不同的生物学过程。通过构建功能基因网络(functional gene network for poplar)发现PtROP基因主要参与了信号转导过程。[结论]杨树PtROP基因家族包含13个成员参与不同的生物学过程,可能主要参与了信号转导过程。     

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)耐久型幼虫(LIV)携带的香茅醇假单胞杆菌(Pseudomonas citronellolis)分离与鉴定

[目的]目前有关松材线虫与伴生细菌的关系及伴生细菌的病原作用是松树枯萎病研究的重点。为了揭示松材线虫与伴生细菌之间存在的密切关系,作者对松材线虫L_IV幼虫携带的细菌进行了分离鉴定。[方法]根据培养性状和16S rDNA序列同源性以及系统发育学等方面进行分析鉴定。[结果]确定L_IV幼虫携带的是香茅醇假单胞杆菌（Pseudomonas citronellolis）,携带率为100%;每条L_IV幼虫携带量在1.4×10⁵~4.5×10⁵。L_IV幼虫生活在松褐天牛体内,是引起松材线虫病侵染流行的唯一虫态;新发现的香茅醇假单胞杆菌能分解纤维素及降解或合成萜烯和酚类化合物。[结论]L_IV幼虫携带香茅醇假单胞杆菌的发现,揭示了松树、松褐天牛、松材线虫、细菌同为一体的紧密关系,并为揭示松树枯萎病机制提供了一种新病原和重要的研究思路。     

淡紫拟青霉航天诱变菌株对南方根结线虫的致病力

[目的]为筛选对南方根结线虫具有高致病力的淡紫拟青霉航天诱变菌株,通过淡紫拟青霉山东寿光菌株搭载神舟八号获得10个淡紫拟青霉航天诱变菌株.[方法]以这10个航天诱变菌株对南方根结线虫卵进行寄生试实验,观察了其发酵液对南方根结线虫卵及二龄幼虫的作用,并对与毒力相关的胞外酶几丁质酶和蛋白酶活性进行了测定.在此基础上,通过盆钵试验方法, 检验菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26对花椒南方根结线虫的防治效果.[结果]结果表明:10个诱变菌株对南方根结线虫卵的寄生率与原始菌株存在分化,其中有3个诱变菌株的寄生率增强,即Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26;这10个诱变菌株的几丁质酶和蛋白质酶的活性与对南方根结线虫卵的寄生率之间呈正相关.在盆钵试验中,菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26对南方根结线虫的根结指数较原始菌株下降88.34%~89.70%.[结论]因此,航天诱变菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26可用于对南方根结线虫的防治.     

麻疯树BRI1基因的鉴定及其在不同发育时期花蕾中的表达分析

[目的]研究油菜素内酯受体BRI1的同源基因(JcBRI1)在麻疯树花发育过程中的作用。[方法]利用RT-PCR技术克隆JcBRI1基因的CDS,以pET-30a(+)质粒为框架构建原核表达载体转化至大肠杆菌进行诱导表达,随后利用LC-MS/MS对表达产物进行质谱鉴定,并以氨基酸序列为基础分析JcBRI1蛋白质结构。利用荧光定量PCR分析麻疯树JcBRI1基因在雌雄花发育的关键时期的表达水平,初步确定其在麻疯树花发育过程中的表达模式。[结果]克隆获得了JcBRI1基因的CDS,长度为3 591 bp。SDS-PAGE检测结果表明:JcBRI1基因在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中均能表达,但在低温环境的表达量更高。原核表达产物的LC-MS/MS鉴定结果表明:JcBRI1氨基酸序列与预期的一致,JcBRI1基因的表达产物为麻疯树BRI1蛋白。对JcBRI1在麻疯树花器官不同发育时期的表达水平进行检测分析,结果表明:JcBRI1基因的表达量在雌花发育的第一个时期即大孢子母细胞时期就达到了最高值,在随后几个时期持续下调;然而,其在雄花各个时期的表达量并无明显差异,表明其很有可能参与了麻疯树雌花大孢子母细胞发育过程。[结论]麻疯树JcBRI1基因为LRR-RLKs家族成员BRI1的同源基因,很有可能参与麻疯树雌花大孢子母细胞的发育过程,至于JcBRI1在麻疯树大孢子母细胞发育过程中的具体作用机制还需进一步研究。